人胚胎干细胞神经分化中VEGF作用的分子机制研究

目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对人胚胎干细胞分化为神经元的促进作用是否与p38MAPK信号通路相关.方法 人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,分为3组:A组:常规诱导组;B组:常规诱导+VEGF(10 ng/mL)作用组;C组:常规诱导+p38...     

人胚胎干细胞神经分化过程中VEGF作用机制的研究

目的观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对人胚胎干细胞分化为神经元的促进作用是否与Notch信号通路有关。方法人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,并分为3组:A组为常规诱导组;B组为常规诱导+VEGF(10ng/ml)作用组;C组为常规诱导+γ-分泌酶抑制剂预处理+VEGF(10ng/ml)作用组。用免疫荧光法检测及计算各组不同阶段细胞阳性率,半定量RT-PCR观察各组神经干细胞Hes1 mRNA表达,MTT法检测3组神经干细胞增殖速率。结果免疫荧光法检测显示,B组产生神经干细胞的阳性率明显高于A、C两组,差异有统计学意义(P0.01),A、C两组之间无显著性差异(P0.05);B、C两组进一步分化为神经元的阳性率均明显高于A组,差异有统计学意义(P0.01),B、C两组之间无显著性差异(P0.05);半定量RT-PCR观察显示B组神经干细胞Hes1 mRNA表达明显高于A、C两组;MTT法检测与半定量RT-PCR结果相似。结论人胚胎干细胞体外分化过程中血管内皮生长因子通过激活Notch信号通路,促进神经干细胞增殖,而VEGF在神经干细胞向神经元分化中的作用与Notch通路无关。     

人胚胎干细胞在无血清mTeSR®1培养基中维持培养和向内皮细胞的诱导分化

背景：传统的人胚胎干细胞培养扩增方法中应用含动物血清培养基,并依赖饲养层细胞培养,这种培养方法显著制约了干细胞的体外培养规模;另外异源动物血清成分介入,使病原污染及免疫排斥的概率显著增加。目的：明确应用无血清培养基mTeSR®1对人胚胎干细胞进行长期体外培养的可行性,并建立诱导人胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的相关技术平台。方法：采用无血清培养基mTeSR®1以非饲养层细胞依赖的方式体外培养、扩增人胚胎干细胞株H9。经过40余次体外传代后,于倒置显微镜下观察其生长形态,并利用免疫荧光染色方法评估其细胞表型。此外,应用条件培养基诱导H9细胞株向内皮细胞方向分化。利用免疫荧光染色技术,定量RT-PCR以及低密度脂蛋白摄取实验对该胚胎干细胞源内皮细胞的表型及功能进行评价、分析。结果与结论：mTeSR®1培养基能够支持H9细胞株在体外以非饲养层依赖的方式进行长期扩增,同时维持其未分化的干细胞潜能。添加血管内皮细胞的条件培养基能够定向诱导H9细胞向内皮细胞方向分化。该胚胎干细胞源内皮细胞不但表达内皮细胞的标志基因(kdr,pecam)和标记蛋白CD31,而且还能够摄取低密度脂蛋白,形成类似微血管结构。提示实验中所提供的培养及诱导分化体系能够支持胚胎干细胞的增殖与分化行为。     

诱导胚胎干细胞向神经元分化及其在中枢神经系统损伤中的应用

胚胎干细胞是一种能在体外增殖,又能保持未分化状态的干细胞,在一定诱导下,胚胎干细胞可向多个方向分化,并生成多种功能细胞。近年来还发现在全反式维甲酸的诱导下,胚胎干细胞可生成神经元及神经胶质细胞等,这为利用胚胎干细胞进行中枢神经退行性变和损伤的治疗打下了基础,由于胚胎干细胞具有细胞株种类多、来源方便、诱导方法可靠易行等优点,因而在神经科学的各个领域有广阔的应用前景。本文对近年来胚胎干细胞体外诱导产生神经细胞以及在中枢神经系统损伤中的进展做一综述。     

小鼠胚胎干细胞体外向神经干细胞的分化研究

目的观察无血清培养法诱导小鼠胚胎干细胞(Embryome stem cell,ESCs)ESCs体外分化为神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)的诱导效率.方法采用无血清培养法诱导小鼠ESCs体外分化为NSCs,对诱导不同时间点的细胞行免疫荧光,RT-PCR检测nestin的表达.结果诱导48 h开始出现nestinmRNA的表达,诱导72 h出现nestin蛋白表达.诱导120 h nestin的表达达高峰,阳性细胞率为(70.3±8.02)%.Nestin阳性细胞呈球形生长,可不断增殖.结论本诱导方法可获得较高纯度的NSCs,所获得的神经干细胞与脑内来源的NSCs有相似的生物学特性.     

序贯法诱导小鼠胚胎干细胞向神经元样细胞的分化

背景：目前小鼠胚胎干细胞体外向神经方向诱导分化的研究报道诸多,但其分化的过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低。 目的：建立一种稳定、高效、简便的实验方法,将小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-08/2008-01在中国医科大学发育生物学教研室完成。 材料：小鼠胚胎干细胞系AB2.1,由美国南加州大学医学院惠赠。 方法：在饲养层细胞上培养小鼠胚胎干细胞,采用“序贯诱导法”,优化实验条件,将小鼠胚胎干细胞向神经方向诱导,对诱导后细胞进行成熟神经细胞标志物鉴定,并用流式细胞仪测定诱导分化比率。 主要观察指标：①倒置荧光显微镜下观察小鼠胚胎干细胞形态特征。②优化序贯诱导法的3个实验条件。③实验条件优化后诱导至第10天分化细胞的形态特征。④诱导后第10天细胞免疫荧光法和蛋白免疫印迹检测神经细胞特异性标志物的表达。⑤蛋白免疫印迹检测诱导分化第4天和第10天细胞的神经细胞β-微管蛋白J1的表达。⑥流式细胞仪检测神经元特异性核蛋白阳性细胞百分比。 结果：①生长于饲养层上的未分化鼠胚胎干细胞聚集呈圆形或椭圆形集落样生长,细胞排列紧密,集落边界清楚。②优化后的“序贯诱导法”在诱导时首次接种所用培养液的血清浓度为12.5%,小鼠胚胎干细胞首次接种最佳密度为1.0×108 L-1,完全更换为无血清培养液的时间为第5天。③诱导至第10天分化细胞出现的突起可达胞体长度的10倍以上。也有小部分分化细胞胞体呈多边形,有多个短突起,仅有一个细长突起,出现突触样结构和生长端样结构,类似神经元。④诱导后第10天细胞免疫荧光法检测神经元特异性标志物巢蛋白、神经细胞β-微管蛋白J1、神经元特异性核蛋白、神经细胞黏附分子1表达阳性,神经胶质细胞标志物胶质细胞纤维酸性蛋白表达阴性。⑤与未分化鼠胚胎干细胞相比,诱导分化第4天和第10天的细胞蛋白免疫印迹检测神经细胞β-微管蛋白J1表达升高(P < 0.05)。⑥流式细胞仪检测神经元特异性核蛋白阳性细胞百分比,计算出诱导第10天胚胎干细胞分化比率为(89.91±2.03)%。 结论：应用优化后的“序贯诱导法”,可稳定、简便的诱导小鼠胚胎干细胞高比率分化为神经元样细胞。     

维甲酸诱导胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元的分化

背景：目前认为直接进行神经干细胞移植后细胞虽能存活,但是只分化成神经胶质细胞,并不能分化成有功能的神经元。 目的：探讨维甲酸诱导对胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外实验,于2008-09/2009-02在辽宁医学院科技实验楼完成。 材料：胚龄13.5 d的SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。 方法：分离胎鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化法体外培养获得神经干细胞。将原代和传代细胞以1×107 L-1接种到培养孔中,分别进行常规贴壁分化培养和维甲酸诱导分化培养。 主要观察指标：神经干细胞的鉴定,光镜及免疫组化检测神经干细胞诱导分化结果。 结果：免疫组织化学检测结果显示,原代和传代后得到的神经干细胞团均呈巢蛋白阳性。常规贴壁分化培养7 d后,神经元多呈椭圆型和近似三角形,胞体大,细胞边缘清楚,胞体上有多个突起;而维甲酸诱导分化培养后,神经元数量增加,形态清楚,但细胞胞体上突起较少。与常规贴壁分化培养比较,维甲酸诱导分化培养后神经干细胞向神经元分化率明显升高(P < 0.01),神经干细胞向神经胶质细胞分化率明显降低(P < 0.01)。 结论：从大鼠胚胎脑海马组织中分离得到可自我复制和多向分化的神经干细胞,维甲酸体外诱导后可以增加其向神经元方向分化的比例。     

Oct-4在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用

目的应用RNA干扰方法抑制胚胎来源神经前体细胞Oct-4基因表达,以观察Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用。方法采用“五步法”诱导小鼠胚胎干细胞向神经元分化,进入扩增期后给予Oct-4干扰RNA,采用Real-timePCR方法检测干扰后细胞Oct-4表达情况,进行分化计数,免疫组化鉴定分化后的细胞,计数分化后的新生神经元比例。结果Oct-4干扰RNA使神经前体细胞Oct-4表达下降约40％,正常未干扰胚胎干细胞分化的神经元为（75．5±5．2）％,GFP组为（73．8±4．7）％,Oct4干扰RNA组为（33．8±2．9）％,与正常组和GFP组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论采用RNA干扰方法可以有效降低神经前体细胞0ct-4的表达,使分化后新生神经元生成减少,证实了Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中发挥着重要作用。     

胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是由早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞,具有发育分化的多潜能性和无限的自我更新能力,在一定条件下可定向诱导分化为某种类型细胞。ESC在体外培养扩增6个月以上仍能保持其多能性,可诱导分化为     

人胚额叶皮层和海马干细胞的自主分化研究

目的 研究人胚胎额叶皮层和海马组织神经干细胞的自主分化特性。观察额叶皮层神经干细胞和海马神经干细胞特性的异同。方法 从人胚胎额叶皮层和海马组织分别分离提出神经干细胞，经无血清体外培养、扩增，形成神经球。神经球贴壁进行不加诱导剂的自主分化。采用细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记分裂增生的细胞，观察细胞的分裂增殖情况。免疫细胞化学法鉴定神经干细胞的自主分化能力，比较额叶皮层和海马神经干细胞的分化特点。结果 从人胚胎额叶皮层和海马分离的神经干细胞具有增殖能力，额叶皮层神经干细胞的细胞倍增时间为3．9d，海马神经干细胞的细胞倍增时间为3．2d。细胞贴壁分化后出现Nestin、GFAP、Tuj-1表达阳性的细胞。皮层和海马神经干细胞分化产生的Tuj-1阳性细胞分别是40．7％和19．3％；皮层和海马神经干细胞分化产生的GFAP阳性细胞分别是59．3％和80．7％。结论 分离培养的额叶皮层和海马神经干细胞具有自我更新和增殖能力，可以向神经元、胶质细胞分化。额叶皮层神经干细胞与海马神经干细胞的倍增时问、自主分化特点和分化为神经细胞和胶质细胞的比率各有不同。     

脑梗死后VEGF及bFGF对神经干细胞增殖分化的机制研究进展

缺血性卒中因其发病机制复杂,迄今为止,仍未发现确切有效治疗方法。随着研究深入, 神经干细胞（neural stem cells,NSCs）作为新的研究靶点,为卒中的治疗提供了新的前景。目前脑梗 死后促进内源神经干细胞增殖分化的影响因素众多,但有研究表明碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）对NSCs 的增殖及分化起到了不容忽视的作用。通过研究VEGF和bFGF在脑缺血后NSCs增殖分化中的作用机 制,为临床脑缺血的靶向治疗提供理论基础。     

Enrichment of Neurons and Neural Precursors from Human Embryonic Stem Cells

Human embryonic stem (hES) cells proliferate and maintain their pluripotency for over a year in vitro (M. Amit, M. K. Carpenter, M. S. Inokuma, C. P. Chiu, C. P., Harris, M. A. Waknitz, J. Itskovitz-Eldor, and J. A. Thomson. 2000. Dev. Biol. 227: 271-278) and may therefore provide a cell source for cell therapies. hES cells were maintained for over 6 months in vitro (over 100 population doublings) before their ability to differentiate into the neural lineage was evaluated. Differentiation was induced by the formation of embryoid bodies that were subsequently plated onto appropriate substrates in defined medium containing mitogens. These populations contained cells that showed positive immunoreactivity to nestin, polysialylated neural cell adhesion molecule (PS-NCAM) and A2B5. After further maturation, these cells expressed additional neuron-specific antigens (such as MAP-2, synaptophysin, and various neurotransmitters). Calcium imaging demonstrated that these cells responded to neurotransmitter application. Electrophysiological analyses showed that cell membranes contained voltage-dependent channels and that action potentials were triggered by current injection. PS-NCAM and A2B5 immunoselection or culture conditions could be used to produce enriched populations (60-90%) which could be further differentiated into mature neurons. The properties of the hES-derived progenitors and neurons were found to be similar to those of cells derived from primary tissue. These data indicate that hES cells could provide a cell source for the neural progenitor cells and mature neurons for therapeutic and toxicological uses.     

4000/人胚胎干细胞源TH 阳性细胞电压门控性通道的初步研究

目的：检测人胚胎干细胞源TH阳性细胞的神经元性电生理特性。方法：采用我们实验室改良后的“无血清四步法经拟胚体培养体系”的方法,体外诱导人胚胎干细胞源性TH阳性细胞,在对其细胞核型及特异性标志物进行检测的基础上,运用全细胞膜片钳记录的方法,检测其细胞膜上电压门控性离子通道的电生理特性。结果：分化前后细胞核型保持正常;诱导得到的细胞形态一致,大多数细胞（>90%）表达多巴胺能神经元的标志β-tubulion和TH,并仍表达神经前体细胞的标志nestin;膜片钳检测显示诱导分化的TH阳性细胞具有神经元性电压门控钠、钾离子通道。结论：人胚胎干细胞经体外定向诱导分化为TH阳性细胞后具有一定的DA能神经元特性,特别是神经元性电生理特性。     

EGF对神经干细胞迁移的影响

目的研究表皮生长因子(EGF)对神经干细胞迁移的影响。方法取孕13—14dSD大鼠胚胎纹状体行神经干细胞培养，7d后取悬浮神经球制成单细胞悬液再培养，EGF作用下连续培养14d后分为实验组和对照组，继续培养，观察：EGF对神经干细胞迁移的影响。结果原代培养的细胞球是神经干细胞，EGF传代培养14d时细胞球大小约100个细胞左右，实验组观察到第14d细胞球增殖变慢，细胞球长出突起与邻近的细胞球相接触，14—17d观察到神经干细胞迁移，17d后细胞迁移现象消失；对照组中未观察到细胞迁移。结论：EGF在某一特定时间内能够诱导神经干细胞迁移。     

碱性成纤维生长因子和表皮生长因子对脊髓神经干细胞增殖与分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对胚胎脊髓神经干细胞(NSC)增殖与分化的影响。方法从14 d胚胎大鼠的脊髓组织中分离培养脊髓NSC,并随机分为3组:EGF组、bFGF组和bFGF+EGF组。通过光镜观察不同时间点各组脊髓NSC克隆细胞团数量及直径大小,并采用免疫荧光染色检测各组脊髓NSC向神经元和星形胶质细胞分化的情况。结果①EGF组培养1、3、7 d后NSC克隆细胞团数量和直径均少于bFGF和bFGF+EGF组,差异有统计学意义(P0.05)。而bFGF+EGF组仅在培养1 d时克隆细胞团数量多于bFGF组,在培养3、7 d时差异无统计学意义。②EGF组分化细胞中神经元比例显著少于bFGF和bFGF+EGF组,星形胶质细胞数量明显大于bFGF和bFGF+EGF组,差异有统计学意义(P0.05)。而bFGF和bFGF+EGF组组间差异无统计学意义。结论 EGF对脊髓NSC克隆形成有一定作用,而bFGF能较好地促进克隆细胞团的形成及生长,两者联合应用在培养早期可显著促进克隆细胞团形成。EGF可诱导脊髓NSC更多分化为星形胶质细胞,而bFGF则可促进脊髓NSC向神经元分化。     

丝裂原在海马神经干细胞培养中的作用

目的 研究表皮生长因子(epidemal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在海马神经干细胞培养中的作用，确定适合海马神经干细胞体外培养的丝裂原。方法 应用EGF和bFGF刺激海马神经干细胞增殖，观察神经干细胞生长、增殖和分化等特性。结果 EGF和bFGF都能刺激神经干细胞扩增，bFGF反应性神经干细胞团增殖缓慢，细胞团中部分细胞迁出，迁出的细胞形成新的细胞团或分化成神经细胞或神经胶质细胞，而且bFGF反应性神经干细胞贴壁很紧，不易传代；相反，EGF反应性神经干细胞快速增殖，易于传代，较少迁移和分化。结论 EGF可促使海马神经干细胞快速增殖，是体外培养海马神经干细胞比较合适的丝裂原。     

神经干细胞移植后安全性及预防措施的基础研究

对神经干细胞（NSC）动物移植后的安全及预防措施进行研究很重要,因为它关系到未来能否开展NSC的临床移植治疗。对NSC移植后的安全构成威胁,主要是NSC诱导过程中来源细胞发生的变异甚至癌变。影响变异的因素很多,但目前对其知之甚少。有学者提出干细胞本身与肿瘤细胞相似,可能会使其发生肿瘤。某些载体和转录因子的介入,会导致NSC发生变异甚至癌变。预防措施包括对载体、转录因子、培养液进行选择,改变培养方法,不要使用未分化的千细胞进行移植等。     

VEGF基因修饰MSCs移植对脑梗死大鼠血管源性机制的实验研究

目的观察经尾静脉注射携带VEGF基因的MSCs移植对脑梗死模型大鼠血管生成方面的影响。方法采用直接贴壁全骨髓法分离纯化MSCs,通过脂质体转染技术将pIRES2-EGFP-VEGF导入MSCs,另采用改良Zea Longa线栓法将40只SD大鼠制成左侧大脑中动脉栓塞/再灌注模型,并随机分4组:VEGF-MSCs组、MSCs组、PBS组、Model组;造模24 h后Model组不做处理,前3组大鼠分别经尾静脉注射1 ml VEGF-MSCs、MSCs、PBS悬液;细胞移植7d后用免疫组织化学法测定脑梗死周围Ang-2、CD34的表达水平。结果 VEGF-MSCs组和MSCs组Ang-2、CD34阳性表达水平较PBS组、Model组高(P<0.05),且VEGF-MSCs组较MSCs组更高(P<0.05);Model组与PBS组差异不明显(P>0.05)。结论经尾静脉注射携带VEGF基因的MSCs移植入MCAO模型大鼠可以促进缺血脑组织新生血管的形成,其机制可能为VEGF上调缺血周边区域Ang-2、CD34的表达水平。