PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.     

PCRRFLP单酶切法鉴别赫坎按蚊复合体的研究

目的建立一种新的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别技术,应用于现场按蚊样本的鉴别。方法用分子生物学软件Vector NTI 9.0,对赫坎按蚊复合体的嗜人按蚊、雷氏按蚊、中华按蚊、八代按蚊4个近缘种按蚊rDNA基因的ITS2区段序列进行限制性内切酶酶切位点预测分析,选择特异性内切酶,建立一种能同时鉴别4种近缘种按蚊的聚合酶链反应限制性片段长度多态(PCR RFLP)单酶切法鉴别技术,并对现场捕获的452只按蚊样本进行基因鉴别。结果软件预测赫坎按蚊复合体近缘种4种按蚊的rDNA基因的ITS2区段可被限制性内切酶Dde I切成大小易于区分的不同片段,PCR RFLP单酶切实验结果和软件预测结果完全吻合。4个疟疾流行区捕获的452只按蚊样本经PCR RFLP Dde I单酶切法鉴定有20只嗜人按蚊、6只雷氏按蚊、391只中华按蚊、35只八代按蚊,与形态学鉴别结果符合率为93.4%,与PCR RFLP双酶切法结果符合率为100%。结论新建立的PCR RFLP Dde I单酶切法基因鉴别技术可准确鉴别赫坎按蚊复合体,比传统的形态学鉴别更为简便、可靠,适合用于复合媒介地区的媒介监测。     

赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的　分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNAITS2)特征。　方法　采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析。　结果与结论　赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2分别为472、452、456和456bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点     

我国赫坎按蚊种团的分子鉴别及中华按蚊的区系分布研究

目的改进赫坎按蚊种团部分成员种的多重PCR鉴别方法,鉴别赫坎按蚊种团中的中华按蚊,研究我国中华按蚊的区系分布及其影响因素。方法依据赫坎按蚊种团成员种中华按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊、比伦按蚊和克莱按蚊的核糖体DNA内转录间隔区2 (rDNA-ITS2)序列差异设计种特异引物,改进多重PCR分子鉴别方法。2013-2018年,在我国8个省(直辖市、自治区)共18个地点,以诱虫灯和人工吸取相结合的方法采集按蚊,依据形态特征初步鉴定为赫坎按蚊种团的成员种。提取单只蚊虫基因组DNA,使用改进的多重PCR方法鉴定种类。对多重PCR法无扩增产物的个体分析rDNA-ITS2序列,在GenBank上进行BLAST比对,确定其种类。查找我国以及韩国和俄罗斯远东地区用分子特征鉴别为中华按蚊的文献,结合本研究结果,汇总中华按蚊采集地的地理位置和气候数据,使用地理探测器模型计算影响决定力q值,分析经度、纬度、年平均气温和年平均降雨量对中华按蚊分布的影响。结果改进的多重PCR法一次扩增即可依据扩增片段大小鉴别赫坎按蚊种团的5个成员种:中华按蚊(490 bp)、雷氏按蚊(313 bp)、八代按蚊(216 bp)、克莱按蚊(386 bp)和比伦按蚊(165 bp)。在我国18个采集点共捕获赫坎按蚊种团按蚊365只,多重PCR鉴别为中华按蚊114只(来自陕西、安徽与山东的采集点)、八代按蚊34只、雷氏按蚊9只、克莱按蚊181只和比伦按蚊5只。22只多重PCR无扩增产物的蚊虫中,经rDNA-ITS2序列分析鉴定为贵阳按蚊2只、类中华按蚊1只、朝鲜按蚊8只、林氏按蚊7只和帕氏按蚊4只。获取用分子特征鉴别为中华按蚊的文献17篇,共汇总了101个采集地信息,其中有中华按蚊分布的采集点80个,无中华按蚊分布的21个地点。地理探测器软件计算获得的q值,从大到小依次为0.592 0(年平均气温)、0.507 2 (纬度)、0.351 2 (经度)和0.214 4 (年平均降雨量)。中华按蚊的分布与年平均气温关系最为密切,其次是纬度。综合分析分布地的纬度和年平均温度等结果显示,年平均气温10℃可以作为划分中华按蚊在我国分布北界线的依据。我国中华按蚊的分布范围包括云南、贵州、重庆、河南、山东、天津、江苏、安徽、湖北、浙江、上海、福建、江西、广西、广东、海南等省(直辖市、自治区)及台湾、香港、澳门特别行政区的全境,以及西藏、四川、甘肃、陕西、山西、河北、北京、辽宁等省(直辖市、自治区)的南部部分地区。结论改进的赫坎按蚊种团多重PCR分子鉴定方法快速简单、客观可靠。综合分析显示划分中华按蚊在我国分布北界线的依据是年平均气温10℃线,中华按蚊在我国的分布应小于之前记载的范围。     

我国雷氏按蚊和嗜人按蚊的分子鉴别和分类地位的探讨

[目的 ]论证我国雷氏按蚊与嗜人按蚊的分类地位。 [方法 ]采用分子鉴别法 (鉴别PCR和rDNA ITS2序列 )检测辽宁及山东两省现场按蚊标本 ,并依据ITS2区序列建立分子系统树。 [结果 ]分子鉴别显示 ,辽宁和山东两省均存在雷氏按蚊和嗜人按蚊。我国雷氏按蚊 (辽宁和山东省 ,n =6 )和嗜人按蚊 (辽宁、云南、河南和四川省 ,n =10 )ITS2序列长度和GC含量分别为 45 1bp、 46 2 % ,44 8bp、 46 0 % ;各地雷氏按蚊和嗜人按蚊序列均无差异 ,但各地嗜人按蚊与对照组江苏的嗜人按蚊相比 ,种内序列差异为 0 88% ;雷氏按蚊与嗜人按蚊种间序列差异为 2 5 7%。分子系统树显示雷氏按蚊与中华按蚊、嗜人按蚊与凉山按蚊亲缘关系较近。 [结论 ]根据分子鉴别 ,确认我国雷氏按蚊与嗜人按蚊为同域分布的 2个独立种     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法，对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测，并对已检测的标本随机抽取数个样本，进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中，中华按蚊占90．85％(586／645)、雷氏按蚊占5．27％(34／645)，无扩增条带的标本占3．88％(25／645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451bp，经Blast比对分析，显示与已公布的序列完全相同；3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊，其它成员种有待进一步证实。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法,对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测,并对已检测的标本随机抽取数个样本,进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中,中华按蚊占90.85％(586/645)、雷氏按蚊占5.27％(34/645),无扩增条带的标本占3.88％(25/645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451hp,经Blast比对分析,显示与已公布的序列完全相同;3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊,其它成员种有待进一步证实。     

用PCR-RFLP技术鉴别嗜人按蚊和中华按蚊的研究

目的　依据嗜人按蚊和中华按蚊rDNA的ITS2区段基因特征 ,建立一种新的嗜人按蚊和中华按蚊基因鉴别技术。方法　对不同地区的嗜人按蚊、可疑嗜人按蚊和中华按蚊样本通过采用特异性ITS2 引物PCR扩增 ,限制性内切酶RsaI和HinfI消化 ,以及琼脂糖凝胶电泳分析进行PCR -RFLP基因鉴别。 结果　不同地区嗜人按蚊rDNA的ITS2 基因PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfI酶切 ,并显示一条 4 5 0bp的酶切DNA条带 ;中华按蚊的ITS2 基因PCR扩增产物则能被限制性内切酶RsaI酶切 ,并显示 4 0 0bp和 2 0 0bp两条酶切DNA条带 ;辽宁可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与嗜人按蚊相同而广东珠海可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与中华按蚊相同。结论　依据rDNA的ITS2 区段基因特征建立的PCR -RFLP技术可用于嗜人按蚊和中华按蚊的基因鉴别。采用该PCR -RFLP基因鉴别技术发现辽宁可疑嗜人按蚊的基因与中国大陆的嗜人按蚊属同种 ,而广东可疑嗜人按蚊的基因与中华按蚊属同种。     

rDNA ITS2区段基因序列分析技术用于江苏省疟疾疫情不稳定地区传疟媒介的鉴定

目的了解江苏省近年来疟疾疫情回升地区媒介按蚊种类。方法采用rDNA ITS2区段基因序列分析技术，对半通宵室外人饵诱捕法和清晨蚊帐内捕蚊法捕获的现场按蚊进行蚊种鉴定。结果经形态学鉴定和PCR基因扩增，并与实验室模式种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊DNA基因比较，现场捕获的按蚊均为中华按蚊。结论中华按蚊仍是目前江苏省疟疾疫情回升地区的主要传疟媒介。     

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的 对浙江省传疟媒介种类进行鉴定，以指导疟疾防治工作。方法 针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2（rDNAITS2）区段基因特征，应用PCR基因鉴别技术，对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果 浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp，与实验室中华按蚊标本一致。结论 中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介，现场调查未发现嗜人按蚊。     

巢氏PCR判定西藏疟疾流行区传疟媒介

目的确定西藏墨脱县疟疾流行区的疟疾传播媒介。方法根据2005、2006和2007年疟疾发病情况,在墨脱县选择了3个疟疾发病较高的自然村,采用人诱、牛诱、灯诱及清晨人房全捕等方法捕获成蚊,经形态学鉴定后麻醉处死,密封干燥,带回实验室-20℃冻存备用,采用混合样本法随机抽取10只多斑按蚊复合体为一份混合标本,提取蚊虫DNA。根据文献采用巢氏PCR扩增疟原虫小亚单位核糖体脱氧核糖核酸(SSUrDNA),并对阳性结果克隆测序,比对证实。结果共捕获按蚊5345只,其中多斑按蚊复合体5190只,带足按蚊155只,提取的360份多斑按蚊复合体混合样本DNA中发现子孢子阳性扩增样品2份,种型鉴定2份阳性混合样本均为伪威氏按蚊,PCR产物经克隆测序,NCBIBLAST同源性比对证实为疟原虫SSurDNA基因片段。结论多斑按蚊复合体中的伪威氏按蚊为西藏林芝疟疾流行区的传疟媒介。     

随州市不同时期按蚊种群监测研究

目的 了解随州市主要传疟媒介现状，为开展疟疾媒介监测提供科学依据。方法 采用回顾性调查和现况调查相结合的方法，调查随州市中华按蚊和嗜人按蚊分布情况，比较不同年代蚊媒密度及种群变化。结果 1985–1996年，随州市共有18个乡（镇）同时存在中华按蚊和嗜人按蚊，且嗜人按蚊占所有按蚊平均比例为52.3%；有26个乡（镇）仅存在中华按蚊。2003–2004年，嗜人按蚊仍分布在原有的18个乡（镇），其占所有按蚊的比例分别为47.0%和38.1%。2005年后再未发现嗜人按蚊，但中华按蚊密度呈上升趋势。结论 随州市嗜人按蚊种群逐渐消失，中华按蚊已成为当地主要按蚊种群，在合适条件下其仍可作为疟疾传播媒介。仍需加强对媒介按蚊的监测和防控，以巩固已取得的消除疟疾成果。     

山东荣成八代按蚊分类地位的探讨

目的探讨山东荣成八代按蚊的分类地位。方法于2009年8月底在山东荣成西郊王家村采集饱血八代按蚊,饲养得子代,对子代成蚊进行形态学鉴定。抽提各型成蚊足的DNA,PCR扩增rDNA-ITS2片段后测序,并用DNAstar7.1软件对所获荣成八代按蚊的rDNA-ITS2序列与文献记录的山东荣成八代按蚊(YSD,AY306128)、四川省八代按蚊(YSC,AY170925)、辽宁省八代按蚊(YLN,AY170923)和韩国八代按蚊(YK,AF146749)的相关序列进行多重比对。结果共采集饱血八代按蚊56只,其中7只顺利产卵,饲养共获得子代成蚊354只,包括八代按蚊型(Y型,成蚊翅脉端白斑和V5.2顶繸白斑均有)240只、近黑按蚊型(P型,两者均无)8只和杂合型(H型,两者其一)106只。亲本和子代成蚊各型间rDNA-ITS2段序列(JN865249,JN865246,JN865247,JN865248)同源性为98.7~100%,与四川省八代按蚊、辽宁省八代按蚊和韩国八代按蚊的rDNA-ITS2段序列同源性分别为98.5%~99.3%、98.7%~99.6%和98.7%~100%,而与原山东荣成八代按蚊同源性仅为6...     

江苏省消除疟疾阶段媒介监测结果分析

目的 分析江苏省消除疟疾阶段媒介监测结果,为输入性疟疾在本地传播的风险评估和消除疟疾后监测提供科学依据。方法 2011-2017年每年6-10月,在江苏省媒介按蚊监测点采用半通宵人饵诱捕法、室外全通宵诱蚊灯法诱捕按蚊,进行按蚊种群和密度监测;采用WHO推荐的强迫接触筒法进行杀虫剂抗性监测。结果 2011-2017年,在江苏省7个媒介按蚊监测点采用半通宵人饵诱捕法共捕获中华按蚊5 106只,年均叮人率分别为1.075、0.786、1.057、0.787、0.790、1.797只/（人·h）和1.185只/（人·h）;采用室外全通宵诱蚊灯法共捕获中华按蚊28 186只,年均灯诱密度分别为57.950、50.932、14.800、4.405、58.070、72.406只/（灯·夜）和17.145只/（灯·夜）。2012年中华按蚊对溴氰菊酯、DDT和马拉硫磷的敏感性、抗性指数均为R级。结论 江苏省传疟媒介主要为中华按蚊,未发现嗜人按蚊;部分疟疾流行区中华按蚊已对溴氰菊酯、DDT和马拉硫磷产生高度抗性。     

2005-2019年贵州省传疟媒介按蚊密度及种群监测

目的 了解2005-2019年贵州省传疟媒介按蚊密度、种群构成及生境分布,为制定全省输入性疟疾传播风险防控措施提供参考依据.方法 2005-2019年在贵州省分别采用人帐诱法和诱蚊灯法开展按蚊密度及按蚊种群监测,对捕获的按蚊进行形态学分类鉴定并计数,并对按蚊生境分布进行分析.结果 2005-2019年贵州省传疟按蚊密度...     

微小按蚊A、C的PCR和同工酶鉴别比较研究

目的?摇比较PCR和同工酶两种鉴别微小按蚊A、C亲缘种的方法。 方法 将现场采集后经形态初步鉴定为微小按蚊的样本，经PCR产物酶切片段长度多态性分析（PCR-RFLP）与乌头按蚊和杰普尔按蚊区分，等位基因特异扩增法（PCR-ASA）进一步鉴别微小按蚊A和C。再将用此方法鉴别后的微小按蚊羽化24 h内单只虫体样本，采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳，加以辨别区分。 结果 经测序验证，PCR方法可以简单明确地将微小按蚊A、C加以鉴别。几种用于鉴别的同工酶中，只有酯酶（EST）同工酶对微小按蚊A、C具鉴别意义。 结论 对于微小按蚊A、C的鉴别，PCR方法明显优于同工酶方法。     

新疆6种蚊虫的rDNA-ITS2区序列分析

测定并分析了新疆4种伊蚊和2种按蚊的rDNA-ITS2区序列,新疆伊蚊、刺扰伊蚊ITS2区长度分别为231bp-256bp、250bp或253bp,其克隆间、种内序列差异分别为0.3-4.3%、0.8%-1.4%,里海伊蚊与长刀伊蚊的长度为330bp、251bp,种内序列无差异;4种伊蚊种间序列差异明显大于种内差异水平,为12.3%-33.5%;赫坎按蚊和米赛按蚊的ITS2区序列长度分别为463bp、311bp,种内个体间无差异。而种间的差异为30.8%,结果显示rDNA-ITS2区序列差异,为形态上易混淆蚊种提供了有意义的分子监别特征。