重组人sCR1在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48～72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

人源性抗角蛋白抗体Fab段在巴氏毕赤酵母菌中的表达及表达条件的优化

目的:用巴氏毕赤酵母表达抗角蛋白抗体Fab段并优化表达条件。方法:将抗角蛋白人Fab原核表达载体p3MH/Fab中的κ链和Fd段基因,分别亚克隆到酵母菌表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建成重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/L和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选得到高拷贝的转化子。对Mut表型鉴定后,优化pH及甲醇浓度等表达条件。结果:优化表达条件后,成功地表达抗角蛋白Fab段抗体。Westernblot分析证实,表达产物具有良好的角蛋白结合活性和特异性。结论:人源性抗角蛋白Fab段抗体在巴氏毕赤酵母菌中获得成功表达,为其进一步的应用研究打下了基础。     

溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体基因真核表达载体的构建

目的：构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体（scFv）基因的毕赤酵母分泌型表达载体.方法：从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中克隆该抗体的重链可变区（VH）基因和轻链可变区（VL）基因（GenBank accession No：DQ011530和 DQ011531）, 并通过基因重组为scFv基因.然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中, 经序列测定后, 电转化入毕赤酵母菌SMD1168中, 将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定.结果：获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv, 经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株.结论：成功地构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体, 为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体在毕赤酵母中的表达

目的构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母分泌型表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆该抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因(GenBank accession No:DQ011530和DQ011531),并通过基因重组为scFv基因。然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中,经序列测定后,电转化入毕赤酵母菌SMD1168中,将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定。以甲醇进行诱导表达,表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。结果获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv,经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。结论构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体并成功表达,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

人sCR1转化克隆菌的快速筛选和鉴定

目的 用G418快速筛选及鉴定重组人可溶性补体受体1型（sCR1）高拷贝转化克隆菌。方法 采用的sCR1重组质粒，经电转化将其克隆入SMD1168细胞中，利用G418的抗性，快速筛选转化克隆菌，并对克隆菌株提取基因组DNA进行聚合酶链反应（PCR）鉴定；该克隆菌经甲醇诱导培养后，对其表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot鉴定分析。结果 从G418快速筛选的酵母克隆菌株中提取的基因组DNA进行PCR鉴定，获得了高拷贝整合的重组酵母克隆菌株，经诱导培养后，对其表达产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定分析，该表达蛋白在SDS-PAGE上表现为相对分子质量大于30 000的蛋白区带，在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体（mAb）识别，成功获得高拷贝整合的重组酵母细胞株，可表达出重组人sCR1融合蛋白。结论 经高浓度G418药物快速筛选的高拷贝SMD1168细胞株，用于表达人sCR1融合蛋白。     

人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母SMD1168中的表达研究

目的得到一株产人乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase-2,ALDH2)的重组毕赤酵母菌株,优化其发酵条件以满足生产和科研需求。方法将ALDH2基因整合到质粒pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K-ALDH2,将重组表达质粒pPIC9K-ALDH2经电转化到毕赤酵母SMD1168中,转化子经MD平板筛选后,用G418筛选多拷贝重组子,测序鉴定。通过改变诱导温度、pH、初始OD值、甲醇浓度等诱导条件,对SMD1168(pPIC9K-ALDH2)发酵的条件进行优化。结果ALDH2cDNA整合到毕赤酵母基因组中,得到SMD1168(pPIC9K-ALDH2);获得最佳的诱导表达优化条件:在28℃、pH=7.0、诱导初始OD600=12、每隔24h添加1.5%甲醇、转速为300r/min,发酵所产生的人ALDH2酶活可达到0.115U/ml,相对较高。结论以蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1168为宿主,分泌表达质粒pPIC9K为载体,能够成功构建重组子SMD1168(pPIC9K-ALDH2)。     

抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。     

人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达

目的：用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体。方法：从已构建好的质粒p3MH／ScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体p^PIC9K，构建成重组质粒p^PIC9K／ScFv，并测序鉴定。通过电转将重组质粒p^PIC9K／ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上。经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含0．5％甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果：通过6天的诱导，该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体，Western blot实验证实表达产物具有特异性。结论：获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体，为其应用研究打下了基础。     

乙型脑炎病毒E蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白。方法：将JEV E蛋白基因亚克隆人真核表达载体pPIC9K，以电穿孔法转化酵母SMD1168。用MD平板筛选重组子、G418筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果：由于糖基化不同，所表达产物的相对分子质量(Mr)约为113000和78000，表达量约为50mg/L。结论：在巴斯德比赤酵母中成功地表达了JEVE蛋白，为制备JEV的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。     

人补体受体1型SCR1-3功能域基因的克隆表达及生物活性鉴定

目的实现人补体受体1型功能域SCR1-3基因的克隆、表达及生物学活性鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,通过逆转录获得cDNA,PCR扩增获得编码CR1-SCR1-3基因序列;克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9K,构建重组质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,菌落PCR、双酶切鉴定后测序;线性化重组质粒电转化毕赤酵母KM71基因组中,经菌落PCR技术筛选在G418平板上生长的多拷贝阳性转化子;摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白表达;镍柱亲和层析纯化目的蛋白;用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果获得了人CR1-SCR1-3编码区序列,测序结果与与GenBank中的相应序列一致;SDS-PAGE和Western-blot表明目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;体外实验证实经纯化后的CR1-SCR1-3能够明显抑制补体溶血。结论成功构建重组表达质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR1-3的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体生物活性。     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。     

可溶性CD14在酵母细胞中的分泌表达与LPS结合活性分析

目的在酵母系统中实现可溶性CD14基因的分泌表达,并进行LPS结合活性分析。方法将可溶性CD14基因克隆入表达载体pPIC9K,用SacI将重组质粒线形化,电转化PichiapastorisGS115细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达。结果经过诱导表达条件的优化,sCD14在pH6.5培养基BMMY中实现了分泌表达。免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体。经流式细胞仪检测,重组产物具有结合细菌内毒素(LPS)的生物学活性。结论具有良好LPS结合活性的重组可溶性CD14分子可以用于进一步的结构与功能研究。