固有免疫调控蛋白PKR串联亲和纯化系统的建立及应用

目的 构建固有免疫调控蛋白--双链RNA(dsRNA)调控的蛋白激酶(PKR)的串联亲和纯化系统(TAP),初步研究PKR蛋白功能,以用于与PKR相互作用的新蛋白的鉴定与功能分析.方法 通过PCR扩增PKR目的基因,克隆至真核表达载体pcTAP-A中.将重组质粒pcTAP-PKR通过脂质体法转染PKR稳定沉默(PKRk...     

双链RNA依赖性蛋白激酶及与其相互作用的蛋白质

双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)是一个经典的干扰素可诱导蛋白,具有抗病毒活性,并参与了细胞信号转导、细胞生长、分化和凋亡等生理过程。此外,PKR在抗病毒的天然免疫应答中亦发挥着十分重要的调控作用。近来,越来越多的研究发现报道了与PKR相互作用的蛋白质,为阐明PKR功能的分子机制提供了重要依据。本文主要介绍了已被证实与PKR相互作用的蛋白质,并对PKR发挥作用的机制进行探讨。     

一种新的研究蛋白相互作用的技术——串联亲和纯化

蛋白质组学的发展及分析技术的进步，客观上要求建立新的生物纯化策略。串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)是一项新的纯化蛋白复合物的技术，它与质谱技术结合使用，已成为当前蛋白质组学研究的重要工具。本文从该技术的每一层面人手，对此方法的研究进展进行概述。     

蛋白质相互作用组学研究策略最新进展

随着人类基因组测序工作的完成,新的生物学后基因组时代已经来临。在蛋白质组和蛋白质组学相继提出的基础上,人类从蛋白质水平全面揭示生命本质的研究进入一个全新的领域—蛋白质相互作用组。在众多研究蛋白质相互作用组的技术中,串联亲和纯化(TAP)技术由于能够在不改变蛋白质生理条件下对其高通量进行研究,渐渐成为该领域的一个重要工具。本综述在介绍常用蛋白质相互作用研究方法的基础上,着重介绍TAP法的原理及其应用。     

用膜亲和层析法纯化小鼠腹水中的单克隆抗体

目的 用膜亲和层析法（MAC）纯化小鼠腹水中单克隆抗体（mAb)。方法 采用尼龙滤膜ZBM作为介质吸附抗人血清白蛋白（HSA）,将含mAb的腹水滤过此ZBM,再将吸附于ZBM上的mAb解离下来,获得纯化的mAb。结果 直径50mm吸附了HSA的ZＢＭ。经１０mL腹水循环滤过两次,即可达到最大mAb结合量。从ＺＢＭ上解离mAb,仅需解离液滤过１次就可完成,纯化的mAb经ＰＡＧＥ检测,只显示１条带。用纯化的mAb做金标记斑点免疫渗滤法（ＤＩＧＦＡ）检测ＨＳＡ标准品时,其灵敏度较用未纯化的腹水时提高了２０倍,结论 用尼龙滤膜ＺＢＭ改进的膜亲和层析法,可用于纯化中的单克隆抗体 且简便、省时、有效。     

核心链霉亲和素基因的克隆及表达

文章采用PCR方法 ,以链霉亲和素菌 (Streptmycesavidinii)基因组DNA为模板 ,克隆出 384bp的DNA片段并以BamHI及XhoI位点装入PSK载体 ,经测序确证为核心链霉亲和素基因 (core strepavidin )。将该基因重组到质粒pET 2 4a ( + ) ,构建重组表达质粒pET 2 4a CS。转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导后得到高效表达。SDS PAGE图谱显示表达产物相对分子质量为15 0 0 0 ,与其基因编码蛋白的理论值相符。HRP标记的生物素作为抗体进行Westernblot,结果在 15 0 0 0处可见特异性条带 ,因此表明核心链霉亲和素能与生物素特异性结合     

串联亲和纯化技术:一种极具潜力的分离、鉴定蛋白复合体的工具

大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白来完成的,所以识别和分析蛋白复合体的组分是研究蛋白功能所必需的。串联亲和纯化技术(TAP)能在生理条件下有效地分离、鉴定蛋白复合体,而无需知道复合体的组成或功能,目前已成功地应用于酵母及其他生物体中的蛋白复合体的成分分析。与质谱技术联合应用可以识别与目的蛋白相互作用的蛋白,进而揭示蛋白质相互作用网络及其功能。     

斑点亲和纯化法分离纯化表皮下大疱病单特异性基底膜带自身抗体

目的研究斑点亲和纯化法在表皮下大疱病(SABD)患者血清中单特异性基底膜带自身抗体(BMZ-Ab)分离纯化中的应用价值。方法对3例免疫印迹阳性的自身免疫性表皮下大疱病(SABD)患者血清中基底膜带抗体(BMZ-Ab),利用转移至硝酸纤维素膜上的人真表皮抗原进行斑点亲和纯化。结果该方法纯化所得的自身抗体,能特异性地结合其所针对的靶抗原。结论从混合微量抗原所产生的多特异性多克隆抗体中分离纯化单特异性抗体的方法是可行的。     

人PDGF-A基因的克隆、表达及表达产物的纯化

目的 克隆血小板衍生的生长因子A链（PDGF-A）的基因，并在大肠杆菌中表达。方法 利用RT-PCR法，从人肝癌细胞系（HHCC）的总RNA中，扩增PDGF-A的全长cDNA，再用PCR法扩增PDGF-A成熟蛋白的全长编码序列，编码序列经测序验证后，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，构建PDGF-A的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白，并进行谷胱甘肽（GST）亲和层析纯化。结果 以RT-PCR扩增的PDGF-A基因的全长为1255bp，以PCR扩增得到其成熟蛋白的编码序列为531bp，构建了PDGF-A基因的原核高效表达载体pGEX-PDGF-A。表达产物主要位于包涵体内，对包涵体蛋白进行变性和复性处理后，利用亲和层析法获得纯化的目的蛋白，结论 成功地扩增到PDGF-A成熟蛋白的编码序列，并在大肠杆菌高效表达，为进一步对PDGF-A功能的研究提供了有利的工具。     

Purification of poliovirus by affinity chromatography.

Poliovirus type 1 (Mahoney strain) has been purified by retention on a Sepharose 4B-antibody column and elution with 3M K thiocyanate. The virus was recovered in excellent yield and its purity was as high as that achieved by detergent treatment followed by sucrose gradient centrifugation. The column could be re-used and its capacity was sufficiently high to make it a useful method for the purification of milligram quantities of the virus.     

Intrahepatic MxA and PKR protein expression in chronic hepatitis C virus infection

The therapeutic effect of interferon-alpha and ribavirin in the treatment of chronic hepatitis C viral infection is limited. To identify patient characteristics that may predict responsiveness to treatment, the intrahepatic protein expression of two directly induced IFN-alpha effector proteins, MxA and PKR, were studied. Forty liver biopsy samples from patients with a variety of chronic liver diseases were stained for MxA and PKR protein using immunohistochemical techniques. In a HCV patient cohort, 30 liver biopsies were stained for MxA and PKR protein prior to treatment with IFN-alpha and ribavirin. PKR protein expression was not upregulated in viral liver disease. In contrast, MxA protein expression was significantly upregulated in viral liver disease (P = 0.005). In chronic HCV liver disease, moderate to strong cytoplasmic expression of MxA protein was observed in hepatocytes and monocytes, indicating endogenous hepatocellular IFN-alpha pathway activation. In the HCV patient cohort treated with combination therapy, strong pre-treatment MxA hepatocyte expression was predictive of a non-response to treatment (odds ratio 9.33; P = 0.01; 95% confidence interval 1.63-53.2). This effect was independent of HCV genotype and viral load. It is concluded that pretreatment hepatocellular MxA expression may become a useful predictor of response to combination treatment with IFN-alpha and ribavirin.     

人IL-24基因的克隆、 表达、 纯化及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的:克隆人白细胞介素-24(IL-24)基因,在大肠杆菌中融合表达,纯化复性,研究此融合蛋白的抗肿瘤活性。方法:分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,RT-PCR技术克隆人IL-24基因。将IL-24插入到pET32a( )中,构建重组表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coli表达。Edman法N端测序,将鉴定正确的蛋白亲合层析纯化。MTT比色法体外分析杀伤肿瘤细胞的活性。结果:获得人IL-24基因,序列分析与GenBank公布一致。表达载体用双酶切和PCR鉴定正确。重组工程菌经IPTG诱导后表达相对分子质量(Mr)约为35000的融合蛋白。N端测序正确,鉴定该蛋白以包涵体形式表达。包涵体经洗涤、溶解后,亲合纯化得到纯度大于95%的融合蛋白。复性后表达产物能显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05)。结论:IL-24融合蛋白在原核细胞中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的重组蛋白,为后续的研究提供实验基础。     

Ezrin的原核表达及与其相互作用蛋白的研究

目的体外筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。方法提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增Ezrin基因。将扩增得到的Ezrin基因片段和pET15b质粒转化E．coli DH5α,获得pET15b-Ezrin重组质粒,双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E．coliB L21-CodonPlus（DE3）-RIL,以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达产物进行Ni^2＋-NTA亲和层析和分子筛纯化后,行SDS-PAGE、MALDI—TOF—MS／MS质谱分析和蛋白质印迹鉴定。裂解Panc-1细胞,获得总蛋白提取液,采用Pull—down方法体外筛选与Ezrin重组蛋白相互作用的蛋白,并对筛选出的目的蛋白进行双向凝胶电泳和MALDI—TOF—MS／MS质谱鉴定。结果RT-PCR扩增出的Ezrin基因片段（1761bp）与理论DNA表达片段大小一致,测序鉴定显示克隆的Ezrin基因序列与GenBank报道序列相符。SDS—PAGE、质谱分析和蛋白质印迹分析显示纯化后Ezrin重组蛋白相对分子质量为69400,与质谱分析的相对分子质量结果相符,为带有His-6标签的特异蛋白。双向凝胶电泳和质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的7种蛋白,其分别为RNA—binding motif protein39（RBM39）、Transgelin（TAGLN）、Albumin（ALBU）、Formin—1（FMN1）、Rho GTPases（RHGBA）、Tetratricopeptide repeat protein 16（TTC16）、Syntaxin—binding protein 1（STXBPI）。结论在大肠杆菌中成功表达、纯化了Ezrin蛋白,并在体外成功筛选出可信的与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。     

抗核糖核酸酶抑制因子抗体的制备与纯化

目的 :制备并纯化抗核糖核酸酶抑制因子 (RI)的抗体。方法 :从人胎盘中提取RI,经亲和层析纯化后免疫家兔制备RI抗体。用rProteinASepharoseFastFlow层析对抗RI抗体进行纯化 ,并用SDS PAGE、ELISA及Westernblot等进行鉴定。结果 :制备并纯化了抗RI抗体 ,经SDS PAGE分析达到了电泳纯。结论 :获得了效价高、特异性强、稳定性好的抗RI抗体 ,为对其深入研究奠定了基础