32例慢性乙型肝炎患者HBV P区的多位点耐药突变分析

目的 深入了解核苷（酸）类似物对乙型肝炎病毒基因组P区耐药性突变的影响,分析其对该区诱导耐药突变的作用.方法 对服用核苷（酸）类似物并且发生病毒学突破的患者,采用PCR产物直接测序法,进行HBV基因组P区耐药性基因测序分析.结果 发现P区可出现多点耐药突变,导致临床上发生交叉耐药和多重耐药.结论 应选用高耐药基因屏障的药物进行初始抗病毒治疗.对长期服用核苷（酸）类似物的患者,应定期监测HBV DNA,以便早期发现病毒学突破并及时干预.     

含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因组逆转录病毒载体的构建及包装

目的：构建含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因组逆转录病毒载体,同时进行逆转录病毒载体的包装,为进一步产生含恩替卡位耐药基因的假病毒,进一步感染肝源性细胞,进行耐药机制的研究做准备。方法: 采用基因扩增、重组和克隆的方法,从构建好的含恩替卡位耐药基因的重组质粒中,扩增出含恩替卡位耐药基因的HBV全基因组,然后插到pLEGFP-N1载体上,再进行重组质粒的转化、提取、纯化和测序,然后将测序成功的重组质粒扩大培养,并转染PT67细胞,最后通过荧光倒置显微镜观察和提取细胞培养上清进行病毒DNA提取。结果: 凝胶电泳分析血清HBV DNA扩增可见3.2 kb条带,HBV DNA和pLEGFP-N1载体连接后可见10.1 kb目的条带,该重组质粒双酶切后可见3.2 kb和6.9 kb目的条带。突变前质粒测序显示含有HBV基因型为C型血清型adr的全基因组,突变后测序证实存在HBV逆转录酶169、184、202、250位点的预期碱基突变。荧光倒置显微镜显示,转染后的PT67细胞有明显的荧光表达,培养上清DNA提取后,经过核酸分析仪检测,最后换算结果显示培养上清假病毒颗粒可达104-105/cfu。结论: 成功构建了含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因重组质粒,并进行了包装,产生了含恩替卡位耐药基因的假病毒颗粒。     

精准医疗在感染性疾病中的应用

感染性疾病严重危害人类的健康与生命,抗生素耐药问题日益严重,感染性疾病的治疗已经进入"后抗生素时代"。精准医疗旨在建立一种在个体基因、环境、生活方式等的基础上的、因人因病而异的、更加精确的个体化医疗,并且已经广泛应用于癌症的治疗和管理。下一代测序技术(NGS)为获取疾病的基因信息提供了强大的技术支持,并在感染性疾病的精准治疗中取得了一定的进展。文章综述了精准医疗在由细菌、病毒及其他一些病原微生物引起的感染性疾病中的应用及前景。应用NGS检测感染性疾病中病原微生物的基因组信息,对致病基因、耐药基因及其他重要的标记精准医疗基因深入解读,有望在一定程度上实现精准医疗的目的。     

两例产NDM肺炎克雷伯菌耐药基因分析及治疗方案

目的 对某三甲医院临床分离的肺炎克雷伯菌进行耐药基因及表型分析，为临床治疗和预防耐药菌感染提供参考。方法 对某三甲医院临床分离的两株产NDM型金属β-内酰胺酶(new delhi metallo-beta-lactamase, NDM)进行全基因组检测。结果 两分离菌株含有多种质粒，在质粒上有NDM的耐药基因位点。结论 产NDM耐药菌的基因主要在质粒上，应加强抗生素的合理使用和感染控制措施，以减缓耐药基因的播散，预防耐药菌的产生。     

采用MALDI-TOF MS和全基因组测序鉴定和分析动弯杆菌属及其亲缘关系北大核心CSCD

目的用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术结合16S rRNA基因测序鉴定动弯杆菌,并通过全基因组测序分析动弯杆菌的耐药基因及该菌属种间亲缘关系。方法将65例细菌性阴道病（bacterial vaginosis,BV）患者的阴道分泌物标本厌氧培养获得25株动弯杆菌,采用MALDI-TOF MS及16S rRNA基因测序鉴定细菌种属,并提取细菌全基因组DNA进行二代测序,测序后得到的原始数据根据SPAdes软件进行拼接组装,并与ARGD耐药基因库比对得到这些细菌含有的获得性耐药基因,最后通过Harvest软件对所有菌株进行核心基因组多样性比较,构建进化树。结果采用MALDI-TOF MS鉴定动弯杆菌属仅能获得柯氏动弯杆菌的鉴定结果;采用16S rRNA基因测序能将动弯杆菌属菌株区分为柯氏动弯杆菌和羞怯动弯杆菌;全基因组分析显示动弯杆菌主要含有四环素耐药基因tet（o）及大环内酯类耐药基因erm（x）,其中tet（o）基因的检出率为84.7%,erm（x）基因的检出率为61.5%;动弯杆菌属两个种内亲缘关系相近,种间亲缘关系甚远。结论本实验结果表明目前MALDI-TOF MS不能鉴定出动弯杆菌属中的羞怯动弯杆菌;动弯杆菌对四环素类及大环内酯类抗生素具有潜在的耐药性;动弯杆菌在种内进化缓慢,暂无新种出现的趋势。     

耐药性细菌碳青霉烯酶检测方法研究进展

耐碳青霉烯类抗生素细菌严重威胁着患者的身体健康和耐药菌感染的治疗和控制.为了有效地预防和治疗由产碳青霉烯酶菌株造成的感染,采取及时有效的检测方法显得尤为重要.国内外学者报道了多种试验方法用来检测产碳青霉烯酶菌株,主要包括表型检测方法和生物化学检测方法;近年来研制的MALDI-TOF MS技术应用于临床微生物鉴定逐渐显示出其优越性,用于产碳青霉烯酶菌株耐药的检测也有较好的临床应用前景.随着基因测序成本的不断下降,多重实时PCR、第二代测序等方法也逐渐应用于临床实验室.本文就碳青霉烯酶的检测方法研究进展加以综述,以期为医学微生物检验工作者选择检测方法提供参考.     

医院耐甲氧西林葡萄球菌感染的生态学特征

目的研究葡萄球菌医院感染的生态学特征，为β-内酰胺类抗生素过度使用导致的医院内肺感染提供预防措施。方法以多重耐药凝固酶阴性葡萄球菌作为主要研究对象，采用临床追踪、痰微生物种群定量分析、苯唑西林和头孢西丁耐药表型筛选以及mecA基因检测及序列同源性比较。结果30％（56／185）重症监护病人分离到耐药表型符合研究对象的葡萄球菌；感染与住院时间、病种、头孢哌酮／舒巴坦和亚胺培南使用有关，常与多重耐药鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌同时出现；当葡萄球菌超过细菌总数的50％时，应高度警惕继发感染和菌群失调；13％（24／185）病例以菌群交替为特征；64％（36156）的病例凝固酶阴性葡萄球菌出现在亚胺培南或头孢哌酮／舒巴坦使用1周后；所有耐甲氧西林葡萄球菌菌株含1个533bp的mecA基因；17株溶血葡萄球菌mecA基因间同源性为99．74％；56株葡萄球菌mecA基因的同源性是97．9％。结论从生态学的3个层面：宏观生态（医院环境、病人条件、抗生素使用等情况）、微生物生态（呼吸道微生物种群变化）、分子生态（mecA基因耐药基因同源性分析）分析葡萄球菌医院感染的特征，为控制医院感染提供新的思路。     

一株同时产KPC-2和NDM-5碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐药基因特征分析

目的分析一株同时产KPC-2和NDM-5碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐药基因特征。方法肺炎克雷伯菌KPN-hnqyy分离自我院血液科一位患者的粪便标本, 使用仪器BD Phenix-M50鉴定菌株并测定最小抑菌浓度;酶联免疫层析试验和PCR方法检测碳青霉烯酶基因型;接合试验检测相关质粒的转移性;PacBio和Illumina平台对菌株全基因组测序, 并在BacWGSTdb数据库中检索菌株MLST分型、耐药基因和质粒类型, 使用软件Easyfig₂.2.3比对基因组和开放读码框序列, BRIG v0.95生成可视化质粒圈图。结果肺炎克雷伯菌KPN-hnqyy对碳青霉烯类抗生素耐药, MLST分型为ST11型, blaKPC-2和blaNDM-5碳青霉烯酶基因阳性;接合子blaKPC-2基因阳性, blaNDM-5阴性;全基因组测序显示菌株含有1个染色体和3个质粒;肺炎克雷伯菌KP69和KP19-2029等与本研究菌株染色体基因组相似性大于99.9%, 且其各自携带的不同种类的质粒上含有相似的IncR和IncFⅠ耐药基因融合区, blaKPC-2基因位于此融合区中一个由T...     

人类基因组作图的研究进展和展望

人类基因组作图主要包括遗传作图和物理作图。现在随着首各种作用方法的应用和位标精度的提高，两种基因普已经完成或接近完成，并为进一步人体基因的定位隆、鉴定分析以及全基因组测序奠定了基础。人类基因组计划的研究重点已经逐渐转向人体基因组３０亿碱基对的测序以及基因分析。     

肺炎克雷伯临床菌株新基因组岛KpGI-2的鉴定

目的 研究肺炎克雷伯临床耐药菌株新基因组岛KpGI-2的结构和功能.方法 采用PCR方法自一株肺炎克雷伯耐药菌株HS04160扩增得到新的插入序列KpGI-2,通过测序以及生物信息学方法分析其序列结构并推测其生物学功能,采用细菌生长试验证实其生物学功能.结果 phe55 tRNA基因位点处PCR扩增得到的6.4 kb的插入序列KpGI-2,序列分析发现其GC含量为38.03%,明显低于肺炎克雷伯菌株基因组平均的GC含量(57.5%).KpGI-2中含有163 bp的重复序列,可以确定为一个新的基因组岛.KpGI-2携带有5个orf,其中orf5与沙门菌属中的Fic(fllamentation induced by cAMP)蛋白具有高度相似性.肺炎克雷伯临床菌株普遍携带有一个高度保守的fic基因以及一个相对保守的fic基因,携带有KpGI-2的临床菌株HS04160丢失了相对保守的fic基因.通过细菌生长试验分析发现orf5以及KpGI-2在cAMP诱导下对细胞生长具有调节作用,KPGI-2的功能可能与细菌生长的调节相关.结论 KpGI-2是位于肺炎克雷伯临床菌株基因组岛插入热点phe55 tRNA基因位点上的一个新基因组岛,其携带的基因与细胞生长相关.     

Solexa测序法研究肺炎克雷伯菌质粒基因组的耐药基因

目的 通过Solexa高通量测序法研究肺炎克雷伯菌的质粒与耐药性的关系.方法 菌株为7年临床分离的206株肺炎克雷伯菌.提取所有菌的全部质粒DNA,Solexa高通量测序获得大规模的短序列.SOAP软件对质粒基因进行分析拼接,分析结果与相关数据库进行比对.MAQ软件分析质粒基因组包含的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)多样性及单核苷酸多态性(SNP)情况.结果 肺炎克雷伯菌质粒基因组中已知的直接与耐药相关的基因就有13种.质粒基因组中存在多个ABC主动外排转运系统.发现4种编码β-内酰胺酶的ORF,其中SHV型ESBLs分布最广.系统分析了206株肺炎克雷伯菌质粒基因组中SHV型ESBLs的SNPs位点,发现存在着大量的非同义替换SNPs位点.结论 发现质粒中SHV型ESBLs基因可能受到选择压力,存在着大量的非同义替换SNPs位点.肺炎克雷伯菌质粒存在外排药物耐药方式,从而形成低水平的非特异多重耐药.     

中国科学家完成3种病原微生物全基因组序列

中国基因组科研又获重大进展 :上海、北京、广西等地科学家联合攻关 ,最近完成了 3种重要的人类和植物病原微生物———钩端螺旋体、表皮葡萄糖球菌和黄单胞菌的全基因组测序 ,取得国际领先的科研成果 .这标志中国独立从事大规模基因测序和生物信息学研究的水平已跃上了一个新的台阶 ,为阐明生物进化等生命科学基础问题 ,促进有关疾病的诊断、开发新的药物 ,深入推进医药、农学等领域的研究打下良好的基础 .参与这项重大研究的国家人类基因组南方研究中心宣布 :为使全球科学家能共享这一研究成果的资源 ,中国科学家今天将这 3种病原微生物的…     

人类基因组作图的研究进展和展望

人类基因组作图主要包括遗传作图和物理作图。现在随着各种作图方法的应用和位标精度的提高，两种基因图谱已经完成或接近完成，并为进一步人体基因的定位克隆、鉴定分析以及全基因组测序奠定了基础。人类基因组计划的研究重点已经逐渐转向人体基因组30亿碱基对的测序以及基因分析。     

肺支原体(Mycoplasma pulmonis)基因组

目前已知最小的细菌基因组是Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ .研究测序显示其中 35 0个基因对于细菌的生存是至关重要的 .Ｍ·Ｐｕｌｍｏｎｉｓ基因组是研究呼吸系统感染的重要研究模型 .支原体是一种人类呼吸、生殖和消化道中粘膜上的微生物 .Ｍ·ｐｕｌｍｏｎｉｓ的许多基因与增加膜蛋白有关肺支原体(Mycoplasma pulmonis)基因组!中华基因网     

六安市新型冠状病毒肺炎病例流行病学及病原学分析

目的:了解六安市新型冠状病毒肺炎病例流行病学特征和基因组变异情况,为疫情防控提供依据。方法:收集六安市69例新型冠状病毒肺炎确诊病例流行病学资料,进行统计学分析。运用全基因组靶向捕获技术和纳米孔单分子测序技术对其中的58份临床样本进行全基因组测序,通过MEGA 4.0软件中的MUSCLE方法进行序列比对和分析,将全基因...     

第三代测序技术：单分子即时测序

DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。从人类基因组计划（human genome project）,到人类基因组单倍型图计划(HapMap),再到人类癌症基因组及个体基因组计划,第一代和第二代DNA测序技术功不可没。特别是近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,为人类从基因水平深入理解疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段,使个体化医疗成为现实。本文回顾了测序技术发展过程,并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。     

不同样本测序前处理方案对冠状病毒基因组高通量测序结果的影响

目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份,一份直接RNA测序(未扩增),另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大,但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性,而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。     

幽门螺杆菌耐甲硝唑基因分型与序列分析

目的 探讨幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp)rdxA基因型及其与甲硝唑耐药性的关系及耐药的分子机制。方法 对54例包括胃炎、消化性溃疡、胃癌患者的Hp分离株进行甲硝唑敏感实验，得到敏感株和耐药株；提取Hp基因组DNA，PCR扩增rdxA基因，并进行限制性片段长度多态性（RFLP）分型；统计学分析基因型和耐药性关系；对1株敏感株和2株耐药株rdxA基因测序分析突变情况。结果 rdxA基因可分为两型：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型中的敏感株和耐药株所占比例为56%和44%，Ⅱ型中的敏感株占16％，耐药株占84％。经统计学分析，rdxA基因Ⅱ型与耐药性有相关性。rdxA基因测序分析显示耐药株存在编码区碱基置换及插入造成的移码突变；非编码区亦存在单个碱基缺失及置换突变。结论 rdxA基因Ⅱ型与Hp的甲硝唑耐药性密切相关，耐甲硝唑株主要表现为Ⅱ型。rdxA基因突变是耐甲硝唑的主要原因。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

一株多重耐药肺炎克雷伯菌KF3的质粒研究

目的 通过对肺炎克雷伯菌KF3质粒DNA全序列测定,从基因组水平研究质粒DNA的结构、功能基因和与宿主菌耐药相关性.方法 碱裂解法提取质粒DNA,构建质粒DNA文库并测序.采用Phred/Phrap/Consed软件包进行序列拼接,Glimmer软件预测开放阅读框架(ORF)及功能分析.结果 构建包含3个质粒DNA的pUC18文库和Fosmid文库,测序获得3个质粒全序列.功能注释分析发现3个质粒均为可接合转移质粒,编码大量耐药相关基因.结论 肺炎克雷伯菌KF3的3个质粒都是可接合转移质粒,将耐药基因在细菌间进行水平转移,造成了耐药菌的播散.