A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。     

H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达与免疫原性初步研究

目的利用真核表达载体构建H7N9禽流感病毒血凝素刺突茎部(HA2)的真核表达质粒,在293F细胞中表达HA2蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法根据pMD18-T-HA中的序列设计H7N9禽流感病毒HA2扩增引物,在下游引物中引入胰酶酶切位点;目的基因经特异性酶切位点克隆入自身带有Fc标签的pFUSE-IgG1-Fc1载体,构建重组质粒HA2-Fc;将重组质粒转染293F细胞,通过间接免疫荧荧光(IFA)和免疫印迹法(WB)鉴定HA2蛋白的表达和免疫原性。结果成功构建H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达质粒HA2-Fc,并在293F细胞中表达出分子量大约为50kDa的重组蛋白。IFA和WB显示该蛋白与抗H7N9病毒鼠多抗具有良好的免疫反应。结论成功构建表达HA2亚单位的真核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫原性,为筛选H7N9广谱疫苗候选分子、广谱中和抗体,及深入研究其致病机理和免疫机制奠定基础。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

H7N9病毒的M1基因序列分析及原核表达

目的克隆H7N9禽流感病毒M1并在原核细胞中表达,为进一步研究其生物学特性、免疫学功能及血清学检测奠定基础。方法用PCR方法从禽流感上海分离株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)cDNA扩增M1基因,并克隆到载体pMD18-T中。经测序证实后,用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体pET28a,并转化E.coli BL21(DE3)菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定及western blot检验。结果 (1)经PCR、测序和酶切鉴定,成功克隆了禽流感H7N9 M1基因;(2)经IPTG诱导的重组质粒pET28a-M1表达出约为28 k Da的融合蛋白,与预期结果相符;(3)对H7N9型禽流感M1基因序列分析表明,与2013年暴发的H7N9型禽流感病毒M1基因核苷酸序列同源性在95.4%~100%,与2006-2011年间暴发的H7N9型流感病毒M1基因序列同源性在69.0%~89.6%,2013年感染人的H7N9型流感病毒与此前暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支。结论成功克隆了禽流感H7N9病毒的M1基因,并在E.coli中得以表达。     

亚洲牛带绦虫NOMO1基因在原核细胞中表达

目的 构建亚洲牛带绦虫NOMO1基因原核重组质粒,进行原核表达、纯化及免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含NOMO1基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒后再行诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,并用蛋白免疫印迹(Western-blotting)分析其免疫反应性.结果 成功建构了原核重组质粒pET28a(+)-NO-MI1.该基因在大肠埃希菌中以包涵体形式存在,破包涵体后纯化蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3得到高效表达.Western blotting结果显示,该重组蛋白可被亚洲牛带绦虫、牛带绦虫病人血清识别,具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫NOMO1基因、表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫B...     

甲型H1N1流感病毒核蛋白NP的真核表达

目的构建甲型SWH1N1流感病毒核蛋白(NP)的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏SWH1N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NP基因,将其克隆至pMD18-TSimple Vector中构建pMD18-T/NP质粒,双酶切pMD18-T/NP与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-NP,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒NP-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将NP-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定NP蛋白的表达,采用亲和层析法纯化NP蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实NP基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NP基因的表达;纯化获得了高纯度的NP蛋白。结论成功克隆了NP基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感病毒快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。     

高致病性禽流感H5N1病毒M1蛋白的重组表达及在感染检测中的初步应用

目的:原核表达重组高致病性禽流感基质蛋白M1并分析其在感染检测中的作用。方法:根据NCBI公布的基质蛋白M1的核苷酸序列设计特异性引物,用高致病禽流感H5N1病人分离的病毒提取病毒RNA进行反转录合成cD-NA,扩增基质蛋白M1基因。将M1基因克隆到pQE30原核表达载体进行非融合表达,纯化重组表达的蛋白并用免疫学方法检测分析。结果:克隆了高致病禽流感H5N1病毒基质蛋白M1基因,并采用pQE30原核表达载体成功表达该蛋白。以该重组蛋白为检测包被抗原建立间接ELISA,检测6份病人血清标本均为阳性,而正常对照人群为阴性。结论:高致病禽流感H5N1病毒M1蛋白可以应用于感染检测中。     

HSV-1 UL18基因重组载体的构建及其编码蛋白VP23的表达

目的:构建含有单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的原核表达载体。方法:先将UL18基因进行全序列PCR扩增,再将PCR产物克隆进pET-28a(+)质粒,最后将重组质粒转化进入原核表达系统E.coli BL21(DE3)中表达出带有6个组氨酸标签的重组VP23蛋白。结果:UL18基因正确重组进pET-28a(+)质粒,并在E.coli BL21(DE3)中表达。结论:成功构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的重组载体,并在原核表达系统表达出其编码的衣壳蛋白VP23且带有组氨酸标签,为进一步优化VP23在发酵中的最佳表达条件,纯化并大量制备VP23,以及制备VP23的多克隆抗体奠定了基础。     

附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的原核表达及纯化

目的 构建人附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的重组质粒pET28a(+)-Eppin,并研究该质粒在原核细胞中的表达及纯化.方法 本研究以人睾丸组织cDNA为模板获得人Eppin基因片段,将其插入pET28a(+)载体His6-Tag上游,构建重组质粒pET28a(+)-Eppin,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IP...     

Ⅰ型流感病毒核蛋白（NP）基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：以Ⅰ型流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA，并在大肠杆菌中进行表达与鉴定。方法：提取流感病毒RNA，以RT—PCR法扩增编码NP基因cDNA。将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体，然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET-28a的多克隆位点中，经酶切鉴定后，将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP。用pET-NP转化受体菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间收集样品，用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。结果：经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达，并在终浓度为1mM的IPTG诱导下，6h其表达量达到高峰，经Western—blot分析证实表达的重组核蛋白具有免疫反应活性，大小约为60kd。结论：流感病毒核蛋白基因编码区基因获得成功克隆和构建，为流感病毒诊断试剂及单抗的研制工作提供了基础材料。     

湖北省2006年甲型流感分离株NP蛋白的克隆及表达

目的采用原核表达系统表达2006年甲型流感分离株NP蛋白。方法参照已发表的甲型流感核蛋白（NP）基因序列及其基因组特性,设计合成PCR克隆引物。从2006年分离的流感病毒毒株中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶,经PCR扩增NP基因,采用原核表达系统进行克隆表达。结果成功获得了纯化的N末端携带多聚组氨酸标签的重组NP蛋白,分子质量约6100kD。结论重组蛋白具有天然蛋白相同的抗原性,可用于流感诊断试剂的研发。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

鹦鹉热嗜衣原体CPSIT-0531融合蛋白原核表达载体的构建、表达及免疫原性检测

目的构建鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)CPSIT-0531原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,检测其免疫原性。方法采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT-0531基因,并构建pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT-0531融合蛋白表达,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA分析His-CPSIT-0531蛋白的免疫原性。结果成功构建了pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;GST-CPSIT-0531免疫小鼠后,ELISA检测免疫小鼠的血清特异性抗体效价为1:640 000。结论成功克隆表达了His-CPSIT-0531,该蛋白具有较好的免疫原性。     

抗流感病毒NS1蛋白抗体的制备及其生物特性研究

目的NSI蛋白在流感病毒复制和传播中起到重要的调节作用,其功能多样,如能调节宿主细胞的蛋白合成、诱导感染细胞的凋亡以及拮抗IFN作用等,此外还有许多功能至今尚未明了。因此,研制一个特异性高的抗NS1抗体,对NS1蛋白功能的进一步研究起到重要作用。方法RT-PCR扩增流感病毒NS1基因,将其克隆进原核表达载体pET-28a（＋）中。然后在大肠埃希菌B121中表达,用切胶纯化方法获取NS1融合蛋白。用该蛋白免疫新西兰大白兔,制备效价较高的多克隆抗体,并测定其效价（间接ELISA法）。用病毒感染细胞实验、Western印迹法和间接免疫荧光实验等方法,观察病毒复制过程中NS1蛋白的表达及细胞定位情况。结果首先构建了能表达NS1蛋白的质粒,并经原核细胞表达获得了NS1蛋白。然后用该蛋白免疫大白兔,获得了效价较高（1：256000）的抗NS1蛋白抗体。实验发现,该抗体可以特异性结合非依赖亚型的甲型流感病毒NS1蛋白。病毒感染后6h即可以检测到NSI蛋白,随着病毒复制时间的延长NS1蛋白表达量变化不明显;24h后NS1蛋白主要分布于细胞核内并能定位于核仁中,也有部分位于细胞质。结论本研究通过原核表达获得了NS1蛋白,并利用常规的免疫方法获得了效价较高的抗NS1多克隆抗体。所制备的多克隆抗体能够有效定位NS1蛋白的表达,并且能和甲型流感病毒各亚型结合,具有较高的特异性。该抗体不仅能用于NS1蛋白功能及其对宿主细胞影响的研究,而且可用于鉴别诊断猪或其他动物中的病毒感染还是接种疫苗后的反应,有较好的开发应用前景。     

禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达

目的研究H5 I151F和H5 I151F＋A134V＋E186D两种氨基酸变异对血凝素蛋白（HA）亲人受体结合的影响,并获得该HA。方法构建载体pRB21’,共感染／转染vp37^-牛痘病毒vRB12和pRB21’,基因同源重组牛痘病毒表达HA,Western免疫印迹法鉴定。结果获得了克隆有H5HA全长基因片段的载体pRB21’,构建了2种重组牛痘病毒re-VV H5 I151F和re-VV H5 I151F＋A134V＋E186D,且能在被感染细胞膜表达这两种HA。结论首次通过构建重组牛痘病毒成功表达了禽流感病毒H5N1的H5HA,为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性奠定了基础。