人护骨素-谷胱甘肽转硫酶融合蛋白基因的构建与表达

目的 克隆人护骨素(OPG)成熟肽段编码区基因并研究在大肠杆菌中OPG-谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合蛋白的表达。方法 采用RT-PCR从人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA中扩增OPG成熟肽段编码区cDNA，构建原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌后经0．1mmoL／L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白，以SDS—PAGE电泳及Western印迹鉴定蛋白表达，应用谷胱甘肽-Sepharose4B柱亲和层析纯化目的蛋白。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，转化菌株可表达人OPG-GST融合蛋白，蛋白表达量约为菌体总蛋白的15．5％。Western印迹表明在相对分子质量66000处融合蛋白能与人OPG多克隆抗体特异性结合。经亲和层析后获得纯度为95．7％的OPG—GST融合蛋白。结论 获得人OPG成熟肽段全长cDNA，在大肠杆菌中表达OPG—GST融合蛋白并以亲和层析法进行纯化。     

GST—FHL2融合蛋白的表达及纯化

目的高效表达和纯化可溶性GST—FHL2融合蛋白。方法（1）PCR法扩增FHL2（Four and a half LIM domains2）基因的编码片段，分别在5′端和3′端加上EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，并克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1；（2）利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒pGEX4T-1-FHL2在大肠杆菌B121（DE3）中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签的融合蛋白；（3）超声法裂解大肠杆菌，应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST—FHL2融合蛋白；（4）通过SDS—PAGE和Western blot验证GST—FHL2的表达。结果（1）成功构建pGEX-4T-1-FHL2重组质粒，测序结果证明FHL2与载体的GST在同一读框；（2）0．1mmol／L的IPTG在23℃的条件下能诱导可溶性GST—FHL2融合蛋白高效表达；（3）在Western blot分析中，GST—FHL2能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别，条带所在位置和GST-FHL2的分子量相符。结论正确构建pGEX-4T-1-FHL2重组质粒，在大肠杆菌BL21中高效表达GST—FHL2融合蛋白，经谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性GST-FHL2融合蛋白。     

重组人肝再生增强因子的克隆、表达及纯化

目的通过构建原核表达系统，在大肠埃希菌中表达重组人肝再生增强因子（hALR）蛋白，为各种急慢性肝损伤及肝衰竭的治疗提供新的治疗方法奠定基础。方法利用正常人肝组织提取总RNA，经一步法逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）获取hALR cDNA全序列，构建原核表达载体hALR—pET28a（＋）转化大肠埃希菌（BL21），诱导表达重组hALR蛋白，以组氨酸为标签进行蛋白纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot鉴定重组蛋白。结果经双酶切和DNA测序证实hALR cDNA正确插入表达载体pET28a（＋），成功表达并纯化得相对分子质量为23000的重组蛋白，低温诱导表达使可溶蛋白明显增加，与预期结果相符。结论成功表达和纯化获重组hALR蛋白。     

人破骨细胞分化因子基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人破骨细胞分化因子(ODF)基因并在真核细胞中表达。方法 以人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA为模板，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法得到ODF的编码区cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ODF，在脂质体介导下转染非洲绿猴肾细胞系(COS)-7，经G418压力筛选建立稳定转染人ODF的细胞系，Western印迹检测其在COS7细胞中的表达。结果获得的人ODFcDNA序列与文献报道的核苷酸序列一致，Western印迹证实稳定转染人ODF的COS7细胞系中有ODF的表达。结论 构建了人破骨细胞分化因子(ODF)的真核表达载体，并在COS7细胞中获得稳定表达。     

人新的生长激素异形体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建含新的生长激素异形体 (GHv)基因全长编码区的pGEM TEasy质粒和GHv 谷胱甘肽转硫酶 (GST)融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌表达出其融合蛋白。方法　采用克隆和亚克隆技术构建GHv GST融合基因的表达质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1并用异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导其表达GHv GST融合蛋白 ,谷胱甘肽 Sepharose 4B纯化试剂盒纯化融合蛋白。 结果　含GHv GST融合基因表达质粒的大肠杆菌表达出相对分子质量约 43 0 0 0的GHv GST融合蛋白 ,SDS PAGE结果显示纯化的融合蛋白为单一条带。结论　成功构建成GHv GST融合基因的表达质粒并且GHv GST融合蛋白在大肠杆菌BL2 1中有高表达。上述工作为制备多抗 ,深入研究GHv基因的功能奠定了基础。     

人抵抗素基因克隆和蛋白纯化

从人脂肪组织用RT PCR扩增抵抗素基因cDNA并测序 ,PCR产物亚克隆到T载体 ,再克隆到原核表达载体 ,表达质粒转化大肠杆菌并诱导表达 ,以Glutathin Sephrose 4B亲和层析柱纯化了目的融合蛋白。     

细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusEg）铁蛋白（ferritin）基因的原核表达重组质粒并表达、纯化该重组蛋白，初步研究其免疫反应。方法将细粒棘球蚴铁蛋白基因亚克隆于表达载体pGEX-6p-1，转化重组体到大肠杆菌B121中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达；用SD争PAGE和Western—blot对表达产物进行初步鉴定，用切胶纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，通过Western-blot对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果重组铁蛋白与GST以融合表达的形式在细菌中高效表达，表达产物为不可溶性的包涵体，蛋白分子量约为42kD。融合蛋白Egferritin／GST能被细粒棘球蚴免疫的家兔血清和特异性小鼠抗血清所识别，同时特异性小鼠抗血清可识别天然抗原囊液、原头蚴可溶性蛋白中约19kD的蛋白条带。结论成功地表达细粒棘球蚴重组铁蛋白，并且该蛋白有一定的免疫原性及抗原性。     

人胰腺癌Hedgehog信号通路中膜蛋白受体PTCH的纯化

目的 构建人胰腺癌PTCH基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法 从人胰腺癌细胞株SW1990抽提总RNA，经RT—PCR扩增出PTCH基因，经纯化、回收目的基因PTCH，将其插入表达载体pET22b，转化E．Coli BL21-CodonPlus^（TM）-RP，构建重组质粒pET22b／PTCH，IPTG诱导表达融合蛋白，免疫印迹进行鉴定，Ni-螯合亲和层析纯化融合蛋白。结果 从人胰腺癌细胞株SW1990克隆出长为789bp PTCH目的片段，成功构建重组质粒pET22b／PTCH，并诱导表达目的蛋白；经Ni-螯合亲和层析得到纯化的融合蛋白。结论 成功构建了重组质粒pET22b／PTCH，并获得纯化的融合蛋白，为进一步研究Hedgehog信号通路在胰腺癌中的发病机制提供了有效工具。     

17β-雌二醇对新生大鼠成骨细胞护骨素和破骨细胞分化因子表达的调节

体外培养成骨细胞，用不同浓度（10^-11～10^-6mol／L）17β-雌二醇干预，RT—PCR测定护骨素、破骨细胞分化因子（ODF）mRNA的表达水平。雌二醇作用后，成骨细胞护骨素表达上调（P〈0．05），以10^-8mol／L最显著；ODF表达无明显变化。雌激素治疗骨质疏松症的作用可能与其在生理浓度时促进成骨细胞护骨素表达有关。     

Tec激酶区作用蛋白RAI16的原核表达和纯化

目的:利用原核表达系统构建Tec激酶区作用蛋白RAI16的融合蛋白表达载体,并进行表达条件的优化和初步纯化.方法:设计基因拼接引物,合成RAl16 cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的RAI16基因与pGEX4T-2载体相连接、转化、筛选.将鉴定阳性的重组子质粒转人大肠杆菌BL-21表达茵中,采用SDS-PAGE电泳分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白的表达.结果:成功构建RAl16蛋白原核表达栽体.采用0.4 mm01/L IPTG、30℃诱导4 h,获得较高表达目的蛋白.融合蛋白主要以包涵体形式表达,将包涵体进行尿素法变性复性和亲和层析柱处理后,获得可溶的高纯度GST-多肽融合蛋白.结论:Tec激酶区作用蛋白RAl16融合蛋白表达的载体和纯化.是制备RAl16多抗以及进一步验证与Tec体外结合作用实验的基础.     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

粉尘螨变应原ProDer f 1编码基因重组pET28a-YARA-Ihc体系的构建及表达

目的构建粉尘螨变应原ProDerf1原核表达载体pET28a-YARA—IhC—ProDerf1,为评价其免疫治疗效果奠定基础。方法用分子克隆技术构建出表达载体pET28a—YARA—IhC—ProDerf1,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-IhC-ProDer f 1,并进行Ni~(2+)-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果经测序证实成功构建了表达载体pET28a-YARA-IhC-ProDer f 1,YARA-IhC-ProDer f 1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为278μg/ml。SDS-PAGE和Westem blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-IhC-ProDer f 1。结论已成功制备出pET28a—YARA—IhC-ProD—er f 1原核表达载体,融合蛋白得到表达和纯化。     

功能未知基因C16orf68在不同肝细胞系内的表达特征

目的获取人基因C16orf68,构建原核表达载体,诱导重组蛋白的表达,制备兔抗C16orf68蛋白多克隆抗体,观察C16orf68在各细胞系的表达特征。方法用RT-PCR技术,从肝星状细胞系LX2的总RNA中获得编码C16orf68基因功能片段的cDNA,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-C16orf68,并导入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达重组的重组蛋白。利用Western blot技术、生物质谱技术对表达的C16orf68进行确认。利用纯化的C16orf68重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C16orf68蛋白的多克隆抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。利用Western blot技术观察C16orf68在多个细胞系的表达特征。结果扩增获得C16orf68基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列相一致,成功表达了C16orf68重组蛋白,经Western blot鉴定、生物质谱Q-TOF分析均显示表达正确。利用纯化后的重组蛋白,制备了兔抗人C16orf68多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价〉1：320 000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好,Western blot结果显示各细胞系该蛋白主要表达于肝实质细胞。结论 C16orf68在肝脏主要表达于肝实质细胞,可能与肝细胞损伤相关。     

埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达获得埃博拉病毒科特迪瓦型的重组核蛋白,并将蛋白纯化。方法将合成的埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白基因亚克隆入原核表达质粒pET-28（a）中,构建重组表达质粒pET-28（a）-C-NP,并将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析表达蛋白及表达量,并用利用His-Band Ni＋柱进行亲和层析纯化,Western blot和蛋白序列分析鉴定表达蛋白。结果所构建的重组表达质粒pET-28（a）-C-NP序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白表达,表达蛋白正确。结论成功表达并纯化了埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

4种血清型登革病毒多表位重组抗原的表达及血清学初步评价

目的在原核表达系统中对登革病毒包膜蛋白(E蛋白)和非结构蛋白1(NS1)融合的B细胞抗原表位进行表达、纯化及血清学评价。方法将B细胞抗原表位用形成α螺旋的连接肽(EAAAK)2作为接头,串联合成1条全新的多表位融合重组基因rE,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白,用镍柱对重组蛋白纯化,并用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。以融合蛋白为抗原,用间接ELISA检测登革热病人血清IgM抗体。结果重组表达载体pET28a-rE构建成功,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,用镍柱纯化获得高纯度的目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示蛋白分子量大小与预期结果相符,建立的间接ELISA具有较高的准确性。结论原核表达的登革病毒多表位融合蛋白具有良好的血清学检测价值。     

重组人psoriasin蛋白的制备与鉴定

目的制备鉴定人psoriasin重组蛋白,为其作用机制的深入研究奠定基础。方法PCR法扩增人psoriasin基因,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达,用Ni2＋-NTA凝胶亲和层析纯化目的蛋白,用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot法对重组蛋白的相对分子质量、纯度和免疫原性进行分析。结果psoriasin编码区基因扩增得到一306 bp特异条带,BLAST分析显示碱基无突变,阅读框架正确;SDS-PAGE显示纯化出相对分子质量为14 kD的重组psoriasin,纯度〉95%;Western blot显示该重组蛋白能与抗人psoriasin单克隆抗体发生特异性反应。结论psor-iasin重组蛋白成功制备,该蛋白具有较好的免疫活性,可用于进一步的研究。     

裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析

目的 通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法 将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果 所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论 成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。     

华支睾吸虫Rho GTPase样基因的识别、克隆表达与免疫鉴定

目的 对新发现的华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）的Rho GTPase样基因进行克隆、表达和免疫学鉴定。方法 将用生物信息学方法识别的华支睾吸虫cDNA质粒文库中的Rho GTPase样基因的完整编码序列（CDS）克隆到原核表达质粒pET-30a（＋）中，在大肠埃希菌BL21中用IPTG诱导表达。表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白印迹（Western blotting）进行分析，并用镍离子金属螯合亲和层析柱进行纯化。结果 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因的完整阅读框含576个碱基，编码192个氨基酸，理论分子量为21．7kDa。PCR、双酶切及DNA测序的结果均表明重组质粒pET-30a（＋）-Rho GTPase构建成功。SDS-PAGE结果表明Rho GTPase基因在大肠埃希菌BL21中获得了高效表达，重组蛋白可被感染华支睾吸虫的猫血清识别，表明其具有免疫反应性。亲和层析获得了高纯度的蛋白。结论 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因可在原核系统中获得有免疫学活性的高效表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗BC097361蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR技术,以LX02细胞总RNA为模板,扩增BC097361目的 基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-BC097361.转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-半乳糖苷诱导并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.大量表达后利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗BC097361蛋白的多克隆抗体.以纯化的BC097361蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测.结果 扩增获得BC097361基因片段,成功表达了BC097361相关蛋白,经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析得到证实.成功获得融合蛋白及兔抗BC097361多克隆抗体.酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价>1:320 000,Western blot、免疫组织化学检测证明多克隆抗体的特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达BC097361蛋白,获得高特异性、高效价兔抗BC097361蛋白的多克隆抗体,为今后研究BC097361蛋白的生物学特性奠定了基础.