白血病细胞和正常细胞生成树突状细胞的比较研究

目的体外诱导髓系白血病原代细胞分化生成树突状细胞(dendritic cell，DC)．并与正常的DC比较。方法分离初诊24例急性髓细胞性白血病和10例慢性髓细胞性白血病患的骨髓单个核细胞以及5例正常人外周血的单个核细胞，用rhGM—CSF 1000U／ml、rhIL-4500U／ml和TNF—α 50U／ml联合培养10天；形态学(Wright染色、倒置显微镜、透射电镜)、免疫学(CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA—DR)鉴定，RT—PCR检测白血病克隆以及混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能。结果细胞因子诱导后，正常细胞和白血病细胞均出现典型形态的树突状细胞，CD80、CD86、CD83、CD1a的表达明显上调(正常和CML—DC的HLA—DR也明显上调)，急性和慢性髓细胞性白血病以及正常细胞来源的树突状细胞具有不同程度的刺激异基因T淋巴细胞增殖的能力。结论无论是急性和慢性白血病细胞均能诱导分化成DC，并且特征完全相似；白血病与正常骨髓的DC在形态和免疫学表达方面相似，但功能较弱。     

肺癌细胞和蛙皮素抑制树突状细胞的产生和功能

目的：了解肺癌细胞株及蛙皮素对树突状细胞（DC）产生及功能的影响。方法：树突状细胞由健康人外周血单个核细胞CD14^ ，在完全细胞培养液中加入1000U／ml GM-CSF和1000U／ml IL-4,培养7天获得，肺癌细胞株CRL－5815，CRL－5826，Bombesin和Bombesin受体拮抗剂加入培养液中，Annxin V检测DC凋亡；流式细胞仪检测CD40，CD86，CD83，CD80，HLA－DR阳性表达。结果：培养7－10天后的DC前体细胞表达高水平的HLA－DR CD80 CD86 CD83 CD40。肺癌及蛙皮素可导致DC前体细胞凋亡，而蛙皮素受体拮抗剂可部分保护蛙皮素致DC凋亡的作用。加入肺癌细胞株或蛙皮素与DC共培养时明显抑制上述细胞表型的表达和DC刺激同种异体T细胞的增殖能力，当加入蛙皮素受体拮抗剂时，DC细胞表达HLA－DR CD80 CD86 CD83 CD40明显增加，接近DC正常对照组。结论：肺癌细胞株及蛙皮素可导致DC的凋亡，抑制树突状细胞的产生和功能。     

两种来源的树突状细胞体外培养及免疫学特征比较

目的对脐血(UCB)和外周血(PB)体外诱导培养成树突状细胞(DC),并进行免疫学特征的比较,探索更好的DC来源。方法UCB和正常成人PB各10例为UCB组和PB组,分离出单个核细胞后,分别加入粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF),白介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)培养基中,培养12d,每天用光镜观察细胞形态,于第3、6d和10d,用流式细胞仪进行CD11c、CD80、CD86及HLA-DR表型分析,于第10d透射电镜和扫描电镜观察细胞形态,并在第12d与淋巴细胞混合培养,对比两种源性DC激发淋巴细胞增殖能力。结果两者均诱导出具有典型形态的DC,UCB组诱导的DC细胞数量明显多于外周血诱导的细胞数(P<0.01)。激发淋巴细胞增殖能力,两者无区别(P>0.05)。结论UCB和PB中的MNs均可在体外诱导为成熟DC,UCB诱导的DC细胞数高于PB,两者激发淋巴细胞增殖能力相同,故UCB有可能成为免疫治疗DC的丰富来源。     

四种不同来源的树突状细胞的性能比较研究

目的:探讨正常人外周血单按细胞、肿瘤患者外周血单按细胞、脐带血CD34^ 细胞、非淋巴细胞白血病细胞来源的树突状细胞性能差异。方法：分别利用正常人及肿瘤患者的外周血分离单个核细胞，黏附贴壁法收集单核细胞，在GM-CSF、IL-4及TNF-α细胞因子组合下诱导树突状细胞；脐带血细胞则利用MACS系统分离纯化CD34^ 细胞作为树突状细胞的前体细胞，培养体系为FL SCF GM-CSF IL-4 TNF-α；非淋巴细胞白血病细胞作为树突状细胞的前体细胞培养条件同CD34^ 细胞。流式细胞仅分析诱导细胞的表型，电镜分析细胞形态。结果：利用4种不同来源的前体细胞在不同细胞因子组合下可分别诱导出DC细胞，细胞CD1a，CD80，HLA-DR的表达较诱导分化前明显上调．细胞形态学表明4种细胞来源的DC均有较典型的DC细胞形态，并均可刺激同种异体T细胞的增生。结论：利用健康人或肿瘤患者外周血可成功诱导出树突状细胞，利用脐血CD34^ 细胞及部分非淋巴细胞白血病原代细胞也可体外诱生出树突状细胞，不同来源的树突状细胞在形态及初步功能上无明显区别。     

人脐血树突状细胞抗神经胶质瘤的体外免疫效应研究

目的　研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞 (DC)对神经胶质瘤细胞的免疫杀伤效应。方法　应用免疫磁珠分选脐血 CD34细胞 ,经 SCF FL3 GM- CSF IL- 4 TNF- α的联合诱导培养 DC,采用相差显微镜观察树突状细胞的形态 ;流式细胞仪作 DC的表面标志检测 ;MTT比色法测定同种异型的混合淋巴细胞反应能力和诱导CTL 毒性的检测。结果　 (1)脐血 CD34细胞在体外经细胞因子联合刺激后呈典型的 DC形态 ;(2 )流式检测 CD4 0、CD80和 CD86等成熟 DC特异性表面标志呈高表达 ,分别与诱导前比较 ,差异均有显著性 ;(3) MTT法测得脐血来源的 DC较外周血 DC刺激同种异体 T淋巴细胞增殖能力弱 ;经肿瘤抗原负载的 DC体外诱导出较强 CTL 毒性。结论　脐血 CD34细胞经体外扩增诱导的 DC具有典型的 CTL 毒性 ,为临床应用脐血来源 DC抗神经胶质瘤的生物治疗提供了理论依据     

脐血CD34^＋细胞体外扩增及树突状细胞诱导的实验研究

目的 研究脐血CD34^＋细胞在体外经造血细胞生长因子扩增后,诱导树突状细胞（DC）并观察该类DC在抗肿瘤免疫中的作用。方法 Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34^ 细胞,以干细胞因子、flt3配体、白细胞介素－3和红细胞生成素体外扩增2周,诱导DC生成,观察肿瘤抗原负载后诱导特异性细胞毒T淋巴细胞生成和对肿瘤细胞杀伤作用。结果（1）脐血经免疫微磁珠法分离可获得高纯高的CD34^ 细胞;（2）2周体外扩增后,细胞数显著增加达150倍;体外集落试验证实该类细胞可形成粒单细胞集落形成单位／（CFU－GM）;（3）扩增的细胞可成功诱导成DC,并具有活化异体淋巴细胞的功能,负载肿瘤抗原后能诱导发生肿瘤特异性淋巴细胞,并可特异性杀伤Daudi肿瘤细胞。结论 脐血来源CD34^ 细胞在体外能成功地扩增,并诱导产生功能性DC。     

人外周血树突状细胞体外稳定、高效培养的新方法

目的:建立稳定、高效的人外周血树突状细胞(dendritic cells,DC)体外培养的新方法。方法:离心获取人外周血白膜层细胞,裂解去除红细胞后获得全部白细胞,贴壁培养1 h获得单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1 000 U/ml 重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500 U/ml,体外培养7 d获得DC,以流式细胞术分析表型,体外混合淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能。结果:从100 ml全血分离获得具有较好活力的贴壁单核细胞仅需2 h;部分肿瘤患者应用传统分离方法不能获得单个核细胞,用新方法仍能从患者外周血稳定地获得足够数量的单核细胞。新方法培养生成DC的数量为传统方法培养生成DC数量的1.8~2.6倍;其中40%~85%为CD1a ,表达高水平的HLA-DR、CD80、CD86,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖。结论:建立了更为稳定的、得率更高的DC体外扩增培养的新方法。     

人外周血单核细胞来源的DC体外分化成熟影响因素的研究

目的： 探讨不同因素对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)体外分化成熟的影响。方法：通过流式细胞仪表型分析、混合淋巴细胞反应、抗原摄取能力检测、DC对T细胞的趋化能力及对IL10的拮抗效应的测定，研究了TNFα，FL，sCD40L，CD40mAb，gp130，IL10等不同因素对DC的体外分化成熟及功能的影响。结果：CD40信号和TNFα都可以有效地使DC上调表达共刺激分子CD80，CD86并进而促进DC激发T细胞的增殖和活化及对T淋巴细胞的趋化作用，但在体外培养体系中，sCD40L能有效地拮抗IL10的抑制效应，而TNFα则明显不如sCD40L有效；激发型gp130单克隆抗体和人重组FL可以显著地促进DC的体外扩增，但是无明显地促进DC分化成熟和促进DC激发T细胞的功能。结论：CD40和TNFα都具有促进DC分化、成熟的能力，但CD40的作用明显优于TNFα。     

肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。     

肺癌患者外周血树突状细胞的生物学特性研究

目的：探讨肺癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）生物学特性。方法：从肺癌患者外周血分离获得单个核细胞，用细胞因子GMCSF (100 μg/L)，IL4 (50 μg/L)体外培养诱导。凋亡肿瘤细胞负载24 h后加入TNFα（10 μg/L）或CD40激发型单抗于培养DC中，继续诱导3～4 d。分别测定DC的表型、DC摄取抗原能力；混合淋巴细胞反应（MLR）对T细胞增殖能力的测定；细胞计数和3HTdR掺入观察DC对T细胞的激发和扩增效应，并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。结果： 患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α，CD83，CD80，CD86和HLADR等DC的相关抗原和共刺激分子；患者的未成熟DC能有效摄取FITCDextran，经TNFα或CD40激发型单抗激发诱导后，成为成熟和有功能的DC,几乎完全失去对抗原的摄取能力，与健康人外周血来源DC组相比无明显差别(P>0.05)；患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的能力。结论：肺癌患者的外周血来源单个核细胞可以诱导成为具有功能的成熟DC。