野生型p53基因转染对宫颈癌HeLa细胞生长及药物敏感性的影响

目的：探讨转染外源野生型p53基因对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用。并了解p53基因与HeLa细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法：利用脂质体介导，将含人野生型p53cDNA的cCB6.p53质粒导入人宫颈癌HeLa细胞株中，筛选阳性克隆，用免疫组化ABC法检测p53基因的表达情况，加入顺铂72小时后，用四唑盐比色试验检测存活的HeLa细胞数。结果：在G418选择培养基中培养两周后，成功地生长出阳性细胞克隆，免疫组化法证实外源性p53基因在瘤细胞中稳定存在并传给子代，p53基因转染对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用。p53表达阳性的HeLa细胞对顺铂的敏感性明显增加，结论：野生型p53基因转染能使HeLa细胞出现生长抑制和化疗敏感性增强。     

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探索ｐ１６基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法采用脂质转染的方法．将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２５１,观察ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒ＰＣＤＮＡ３为对照。免疫组化、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｐ１６基因表达,对转染后细胞生长情况、细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ,ＣＤＤＰ）敏感性的变化进行分析。结果外源ｐ１６基因的高水平表达显著掏了胶质瘤Ｕ２５１细胞的生长,克隆形成率减少,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了Ｇ１期阻滞,同时,细胞对顺铂的敏感性降低,化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论外源野生型ｐ１６基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,同时降低Ｕ２５１细胞对顺铂的化疗敏感性。ｐ１６基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。     

脑胶质瘤p16基因转染对细胞生长及放射敏感性的影响

目的　探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法　将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6,筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照,免疫组化检测p16基因表达,用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果　转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达,克隆形成率减少,生长速度明显减慢,对辐射的敏感性增强。结论　导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性。     

基于类器官模型的宫颈癌铂类化疗药物敏感性的免疫组化指标分析与探索

目的研究免疫组化指标CEA、CK5/6、CK7、Ki-67、p16、p53、p63表达与宫颈癌对铂类等化疗药物敏感性之间的关系。方法选自同济大学附属第十人民医院收治的宫颈癌患者术中肿瘤组织;进行肿瘤化疗药物敏感性检测,运用液体覆盖技术3D细胞培养联合ATP-TCA,评价药物敏感性;检测宫颈癌病理标本免疫组化指标CEA、CK5/6、CK7、Ki-67、p16、p53、p63表达水平;对免疫组化指标表达与宫颈癌对化疗药物的敏感性进行Spearman等级相关分析。结果24例宫颈癌患者的3D肿瘤细胞对紫杉醇+顺铂、顺铂的敏感率最高（65%、60%）,对吉西他滨的敏感率较高（38%）,对紫杉醇+卡铂、卡铂、奈达铂的敏感率较低（6%、20%、6%）,对紫杉醇、多西他赛的敏感率为0%。免疫组化指标Ki-67表达水平与宫颈癌3D细胞对紫杉醇+顺铂的敏感性呈正相关（P<0.05）,p63表达水平与宫颈癌3D细胞对紫杉醇+卡铂的敏感性呈负相关（P<0.05）,CEA表达水平与宫颈癌3D细胞对吉西他滨敏感性呈负相关（P<0.05）,其余指标与化疗药物敏感性无明显相关性。结论基于3D细胞类器官模型,免疫组化指标Ki-67、p63、CEA表达水平可初步预测宫颈癌患者对紫杉醇+顺铂、紫杉醇+卡铂和吉西他滨化疗的敏感性。     

转染野生型p53对宫颈癌HeLa细胞COX-2表达及生长影响的研究

目的 研究外源性野生型p53（wt p53）基因对宫颈癌HeLa细胞中环氧合酶-2（COX-2）的影响和对HeLa细胞的生长抑制作用.方法 将p53的HeLa细胞按是否转染p53分为实验组和对照组.实验组利用脂质体介导的转染技术将野生型p53基因转染到HeLa细胞中,wt p53的表达使用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）鉴定,用蛋白质印迹法（Western blot）与RT-PCR检测转染前后COX-2蛋白和COX-2 mRNA表达的变化.CCK-8染色法绘制细胞生长曲线.结果 野生型p53基因转染后HeLa细胞中的COX-2蛋白和COX-2 mRNA表达减少.通过对细胞生长曲线的分析,转染后较转染前生长明显减慢（P〈0.01）.结论 外源性wt p53基因表达可抑制宫颈癌HeLa细胞中COX-2蛋白和COX-2 mRNA的表达;wt p53可能通过抑制COX-2对宫颈癌HeLa细胞产生抑制作用.     

抑癌基因联合转染对膀胱癌细胞的生长抑制作用研究

目的　探讨抑癌基因 p5 3和 Rb对膀胱癌细胞的生长抑制作用。方法　利用逆转录病毒和电穿孔法将 p5 3、Rb单独或联合导入膀胱癌细胞株 T2 4中 ,Northern杂交等证实外源目的基因的表达后 ,观测并比较不同转染后细胞的生长、增殖水平和成瘤性等。结果　获得 p5 3、Rb单独和联合转染的 T2 4细胞 ,Northern杂交等证实 T2 4细胞中 p5 3失活而 Rb正常 ,转入的外源野生型 p5 3基因和 Rb基因均被表达。与未转染的对照组 T2 4细胞相比 ,转入 p5 3的细胞其生长速率明显降低 ,细胞增殖受抑制 ,软琼脂克隆形成能力丧失 ;而只转染 Rb的细胞除软琼脂克隆形成能力有所降低外 ,细胞生长和增殖未受明显抑制。结论　外源野生型 p5 3能抑制 T2 4生长并降低其成瘤性 ,增加 Rb的表达对细胞生长无明显抑制作用。p5 3对 T2 4细胞的生长抑制作用与外源 Rb基因导入与否无明显关系 ,Rb表达水平正常的膀胱癌细胞其异常增殖可能与 Rb蛋白磷酸化状态的关系更为密切。     

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的 探索Ｐ１６基因在脑胶质瘤生发展过程中的作用及其与脑胶细胞顺铂化疗敏感性关系。方法 采用脂质体转染的方法，将外源墅生型Ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２６１，观察Ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤的作用，并筛选阳性克隆。同时以空本质粒ＰＣＤＮＡ３为对照，免疫组化Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测Ｐ１６基因表达，对后细胞生长情况，细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｏｒｏｐｌａｔｉｕｍ，ＣＤＤＰ     

聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应

目的以自行合成的聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）纳米凝胶为载体转染E1A基因,并观察E1A基因对肝癌细胞体外生长的抑制作用及其对化疗药物的增敏效应,初步探讨其作用机制。方法经PEI介导,将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌H22细胞,RT-PCR证实其转染,G418筛选出阳性克隆细胞,观察EIA基因对该细胞系生长的抑制作用。用MTT法测定转染E1A基因前后,顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶、博来霉素对肝癌H22细胞的效应。结果质粒psv-E1A测序结果与基因库E1A基因序列完全相符。G418筛选出阳性克隆细胞。RT-PCR结果显示PEI能转染质粒psv-E1A并有稳定的表达。转染E1A基因后,H22-E1A细胞对顺铂、博来霉索、泰素的敏感性显著提高（P〈0.01）,而对5-氟尿嘧啶的敏感性无明显变化（P〉0.05）。结论PEI能正常转染质粒psv-E1A,E1A基因能够明显抑制肝癌H22细胞的生长,并明显提高其对顺铂、博来霉索及泰素等化疗药物和放射线的敏感性。其机制可能与E1A基因改变肿瘤细胞的增殖状态和细胞周期时相有关。     

PTEN影响宫颈癌Hela细胞对顺铂的化疗敏感性

目的:通过转染PTEN基因表达载体,提高宫颈癌Hela细胞中PTEN的表达水平,观察能否影响Hela细胞对顺铂的敏感性,并探讨其分子学机制.方法:将培养的宫颈癌Hela细胞分为空白对照(未转染质粒的Hela细胞)、质粒对照(转染空质粒的Hela细胞)和PTEN转染(转染PTEN表达载体的Hela细胞)3组.分别用RT-PCR和Western检测各组Hela细胞中PTEN的mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测各组Hela细胞对顺铂的化学敏感性;RT-PCR检测各组Hela细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表达水平.结果:PTEN转染组Hela细胞中PTEN的表达水平比另2组细胞显著增高(P＜0.01);经顺铂处理后,PTEN转染组Hela细胞生长抑制率比其它2组显著增高(P＜0.01),PTEN转染组Hela细胞中PI3K被显著抑制(P＜0.01).结论:PTEN能增强宫颈癌Hela细胞对顺铂的化疗敏感性,它可能通过下调Hela细胞中PI3K而导致Hela细胞对顺铂耐药性下降.     

脑胶质瘤p16基因转染对细胞生长及放射敏感性的影响

探索ｐ１７基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及ｐ１６基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞珠Ｕ２５１、Ｃ６，筛选阳性克 时以空载体质粒ｐＣＤＮＡ３为对照，免疫组化检测ｐ１６基因表达，用ＭＴＴ法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果转染Ｐ１６基因的Ｕ２５１、Ｃ６细胞有外源Ｐ２１６基因的整合及表达，克隆形成率减少，生长速度明显减慢，对辐射的敏感性增强。结论导入外源野生型     

外源性p53基因对人胃癌细胞的放射增敏作用

目的:评价外源性p53基因对人胃癌细胞放射敏感性的影响.方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将人野生型p53基因导入不同p53状态的4种人胃癌细胞系,用免疫组化法及Western blot法检测p53基因在胃癌细胞中的表达;用细胞存活份数来表示细胞的生长抑制情况;用流式细胞计数、细胞DNA片段化分析和TUNEL检测细胞凋亡.结果:[ HTSS 在高效靶比病毒剂量下,外源p53基因在4种胃癌细胞的胞核中均高效表达,并可使细胞产生明显的G2/M 阻滞和凋亡,使细胞存活份数明显减少.而且这种作用不依赖细胞内在的p53基因状态.单独照射4 Gy,对野生型p53细胞的生长抑制和致凋亡效应明显,而对其它3种细胞的作用较弱 .照射4 Gy结合Ad-p53时,外源p53基因可显著增强照射引起的G2/M期阻滞和凋亡及生长抑制作用,对4种胃癌细胞放射增效比高达2.3～3.6.结论:腺病毒载体介导的野生型p53基因转染4种胃癌细胞后有明显的放射增敏作用.     

人肝癌细胞肿瘤抑制基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的为了解肿瘤抑制基因ｐ５３和Ｒｂ基因与肝癌对药物敏感性之间的关系，本实验用逆转录病毒介导将野生型ｐ５３或Ｒｂ基因导入人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１并观察其药物敏感性的改变。方法将野生型ｐ５３ｃＤＮＡ或ＲｂｃＤＮＡ克隆在逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，转染人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１，筛选阳性克隆，同时以空载体ｐＬＸＳＮ和反义ｐ５３基因作为对照，免疫组化检测ｐ５３或Ｒｂ基因的表达。加入化疗药物４８ｈ后掺入３Ｈ－ＴｄＲ，１８ｈ后检测ＣＰＭ值。结果成功地构建了分别含野生型ｐ５３、Ｒｂ或反义ｐ５３的逆转录病毒载体，转染ＳＭＭＣ７７２１细胞系后获得了ｐ５３或Ｒｂ的表达；与亲代７７２１细胞相比，ｐ５３或Ｒｂ的表达阳性的７７２１细胞的生长速度均明显减慢，ｐ５３表达阳性的７７２１细胞对阿霉素的敏感性明显增强，同样条件下，Ｒｂ在７７２１细胞系内的表达则对阿霉素敏感性无影响。结论野生型ｐ５３基因转染能提高人肝癌７７２１细胞对阿霉素的敏感性     

野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

黄芪注射液联合顺铂对HeLa细胞生长的影响

目的研究不同浓度黄芪注射液单独或联合顺铂对HeLa细胞生长的影响。方法单独或联合应用不同浓度的黄芪注射液、顺铂作用于人宫颈癌HeLa细胞系,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测其对细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2的表达。结果 MTT法检测结果显示黄芪注射液对HeLa细胞生长影响的最佳作用浓度为1 000 g.L-1,最佳作用时间为48 h。黄芪注射液组、顺铂组、黄芪注射液联合顺铂组HeLa细胞凋亡率均高于对照组,且黄芪注射液联合顺铂组HeLa细胞的凋亡率显著高于黄芪注射液组和顺铂组,各组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。各组间比较,黄芪注射液联合顺铂组Bax、p53蛋白的表达量最高,Bcl-2蛋白的表达量最低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论高浓度的黄芪注射液对HeLa细胞有促凋亡作用,可协同顺铂增强对HeLa细胞的促凋亡作用,其作用机制与增强p53、Bax蛋白的表达、减弱Bcl-2蛋白的表达有关。     

腺病毒介导hCTR1转染用于治疗顺铂耐受宫颈癌的基础研究

目的 诱导培养对顺铂耐药的人宫颈癌细胞株,并进一步研究针对宫颈癌细胞耐药的机制和相应的治疗方法。 方法 采用浓度梯度递增法使用顺铂处理人宫颈癌细胞C-33A,诱导出顺铂耐药细胞株C-33A/cis后,通过Western blot检测铜离子转运蛋白（copper transporter 1,CTR1）的表达改变,使用顺铂耐药细胞株C-33A/cis建立肿瘤皮下荷瘤模型,使用转染有hCTR1基因的腺病毒注射液（ad-hCTR1）并联合顺铂给药,观测肿瘤体积的改变,并在最后一次注射10 d后处死小鼠,通过免疫组化方法检测肿瘤组织中CTR1的表达。 结果 浓度梯度递增法诱导出的耐药细胞株C-33A/cis较亲代细胞C-33A对顺铂引起的细胞毒性敏感性下降,顺铂的半致死剂量浓度（IC₅₀）由（1.86±0.08）μmol/L提升至（8.11±0.21）μmol/L。Western blot结果显示耐药细胞C-33A/cis中CTR1的表达降低。利用顺铂耐药细胞株C-33A/cis建立的皮下瘤模型,在给予ad-hCTR1后,肿瘤组织内可检测到CTR1表达增高;对荷瘤鼠给予腺病毒转染CTR1联合顺铂给药后,肿瘤体积增长受到抑制。 结论 腺病毒转染CTR1联合顺铂给药可能提高耐药性宫颈癌的治疗效果。     

脂质体介导的p53基因转染对鼻咽癌细胞作用的研究

目的 通过转染野生型p53基因,观察其对鼻咽癌细胞CNE2生长的影响.方法 将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒,用脂质体(lipofectamine)介导的方法转染人鼻咽癌CNE2细胞,以RT-PCR检测p53基因的表达,通过细胞生长曲线、AO/EB染色和流式细胞术等方法对转染细胞的生物学行为进行检测.结果 人鼻咽癌CNE2细胞转染p53基因后,基因在细胞中表达增加,细胞的生长受到抑制,在荧光显微镜下观察到凋亡细胞增多,流式细胞技术显示细胞凋亡率增高.结论 采用脂质体转染野生型p53基因的方法,可抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长,诱导鼻咽癌细胞凋亡.     

葛根素抑制人子宫颈癌细胞株HeLa增殖和诱导凋亡作用研究

目的:探讨葛根素对人子宫颈癌细胞株HeLa的作用及其机制。方法:取对数生长期的HeLa细胞分别用不同剂量的葛根素处理(0μmol,12.5μmol,25μmol,50μmol)。细胞培养48 h后,利用MTT法检测HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡水平,RT-PCR法检测Bax mRNA和Bcl-2 mRNA水平。Western blotting法检测Wnt、β-catenin、Bax、Bcl-2、p53和p21表达水平。结果:葛根素成剂量依赖性地抑制HeLa细胞增殖,促进细胞凋亡,促进BaxmRNA表达,减少Wnt、β-catenin、Bcl-2 mRNA、p53和p21表达。结论:葛根素可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制与减少Wnt/β-catenin信号通路活化相关。