Effects of Serum from Aplastic Anemia patients on the Expression of Cyclin D3 Isoform in Umbilical Cord Blood CD34＋ Cells

The pathogenesis of aplastic anemia (AA) was explored and the effects of AA serum on the expression of crucial cyclin D isoform (cyclin D3) in umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells were observed. The CD34 cells were isolated from the cord blood with MIDIMACS Semi-solid methylcellulose culture technique was used to measure the formation of CFUGM; The expression level of cyclin D3 was assayed by semi-quantitative RT-PCR and Western-blot after the hematopoietic stem/progenitor cells were incubated in AA serum. The results showed that the AA serum could inhibit the formation of CFU-GM and down regulate the expression level of the cyclin D3 at the mRNA and protein level respectively. In conclusion, the AA serum could inhibit the proliferation of hematopoietic stem cells and down regulate level of cyclin D3, which might be one mechanism of hematopoiesis inhibition in AA.     

脐带血造血干/祖细胞关键细胞周期蛋白D亚型的鉴定

目的：确定控制脐带血造血于／祖细胞增殖的细胞周期蛋白D(Cyelin D)关键亚型。方法：用Midi-MACS免疫磁珠阳性分选的方法分离出脐带血CD34^ 细胞，在体外扩增以后，用RT—PCR和Western Blot分别在mRNA水平和蛋白水平检测Cyclin D不同亚型的表达。结果：mRNA在Cyclin D1无表达，Cyclin D2、Cyclin D3有表达；蛋白在Cyclin D1无表达，Cyclin D2弱表达，Cyclin D3高表达。结论：控制脐带血造血干／祖细胞增殖的Cyclin D关键亚型是Cyclin D3。     

Multidrug resistance pglycoprotein function of bone marrow hematopoietic cells and the reversal agent effect

Intheprocessofchemotherapyfortu-mors,multidrugresistance(MDR)P-gly-coprotein(P-gp)expressionoftenoccurstoinduceMDR.PreviousstudiesconfirmedthatmanynormaltissuecellsalsoexpressedP-gp['J.So,whenthedrugsthatdisturbP-gpfunctionwereusedtoreverseMDRofthetumorceIls,thenormalP-gpfunctionofthesecellswouldbeaffectedtocausedamage.Recently,new-typeMDRreversalagentswerebeingdeveIopedandtheirphar-macologicalactionwasagainsttheP-gponthetumorcellmembrane[2].However,theeffectsoftheMDRreversalagentson…     

The effects of total saponins of panax ginseng on hematopoietic progenitor cells in healthy humans and aplastic anemia patients

Ginseng is said to have beneficial effects on anemia. The proliferation effects of total saponins of Panax ginseng (TSPG) on hematopoietic progenitor cell in healthy individuals and 29 patients with aplastic anemia (AA) were observed through bone marrow cultures of burst forming unit-erythroid (BFU-E), colony forming unit-erythroid (CFU-E) and colony forming unit-granulocyte/macrophage (CFU-GM) in vitro compared with methyltestosterone (MT). The results suggest TSPG might prompt the proliferation of normal progenitor cells at a concentration of 20 μg/ml. The numbers of BFU-E,CFU-E and CFU-GM increased by 37.8±2.9%, 31.4±2.9% and 33.3±4.0% respectively overthe controls; furthermore TSPG was still useful to BFU-E, CFU-E growth without Epo in vitro, although the colony numbers were much lower. Otherwise MT was useless to CFU-GM. Of the 29 patients with AA, 14 who responded to MT showed sensitivity to TSPG in marrow culture (the rising rate of colony formation exceeded 30%), but immune-mediated AA (patient’s peripheral blood mononucleated cell suppressed normal hematopoiesis) and stem cell decreased AA (few of colonies were formed) showed almost no expression for TSPG activity because of the immunological suppression system and the absence of progenitors.     

血小板内皮细胞粘附因子对脐血造血细胞的影响

目的观察ＣＤ３１分子在脐血造血细胞的分布和ＩＰ２８Ａ－ＣＤ３１单抗对造血祖细胞ＣＦＵ－ＧＭ和ＢＦＵ－Ｅ的集落形成的影响,方法应用单克隆抗体结合免疫荧光流式细胞仪技术进行免疫分型和分选脐血造血细胞。结果ＣＤ３１分子分布于所有脐血的ＣＤ３４＋细胞和部分Ｔ、Ｂ、ＮＫ淋巴细胞,ＩＰ２８Ａ－ＣＤ３１单抗在ＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＥＰＯ存在下能明显增加脐血ＣＦＵ－ＧＭ和ＢＦＵ－Ｅ的集落产率。结论ＣＤ３１分子广泛分布于脐血造血细胞,并对脐血造血细胞有正调控作用。     

脂多糖对脐血CD34^＋细胞体外增殖的影响

目的：研究脂多糖（LPS）对脐血干／祖细胞体外增殖的影响,探寻脐血干／祖细胞体外扩增的新方法。方法：将不同浓度的自制脂多糖和标准脂多糖分别加入含有脐血CD34^＋细胞的液体培养体系中培养,采用MTT测定方法分别测定脐血CD34^＋细胞增殖率。结果：不同浓度的自制脂多糖与标准脂多糖均可出现低浓度促进脐血CD34^＋细胞增殖,高浓度抑制其增殖的作用。最佳效应浓度分别在30U／mL及10mg／L。结论：脂多糖对脐血CD34^＋细胞体外增殖可能具有调节作用。     

再生障碍性贫血患者造血祖细胞及免疫机制的研究

目的探讨再生障碍性贫血(再障)的发病机制。方法采用甲基纤维素及胶原半固体培养法对56例再障骨髓CFU-GM、CFU-E、BFU-E及CFU-M K、BFU-M K进行培养;采用APAAP法及双抗体夹心酶联免疫吸附法(EL ISA)对再障患者外周血T细胞亚群、血清sIL-2R进行检测。结果再障患者CFU-GM、CFU-E、BFU-E及CFU-M K、BFU-M K集落数均低于对照组,且严重型再障集落数减少程度与慢性再障相近;再障患者CD 3亚群细胞无变化,CD 4亚群细胞减低,CD 8亚群细胞增高,CD 4/CD 8降低,重型再障患者血清sIL-2R中水平高于正常对照组与慢性再障。结论骨髓造血祖细胞数量减少是再障发病的重要因素,其减少程度与再障的病情有关;细胞免疫功能异常及造血负调控因子可能在再障发病中起一定的作用。     

脐血造血干/祖细胞体外扩增后端粒酶活性的表达

目的 探讨脐血造血干／祖细胞在不同细胞因子支持的体外扩增过程中端粒酶活性的表达及意义。方法 应用PCR—ELISA方法检测脐血造血干／祖胞体外扩增前后的端粒酶活性、细胞扩增倍数及免疫表型的变化。结果 新分离的脐血CD34^ 细胞表达弱的端粒酶活性，体外培养7d，细胞端粒酶活性达最高，干／祖细胞扩增倍数也明显增高，随着培养时间的延长，细胞分化成熟，端粒酶活性减低。结论端粒酶的活性的升高与造血干／祖细胞的扩增相一致；从临床应用价值来看，脐血CD34^ 细胞体外扩增时间应以7d内为宜；IL-3促分化能力大于G-CSF。     

儿童再生障碍性贫血骨髓祖细胞的测定和意义

目的通过对再生障碍性贫血 (AA)患儿红系 (BFU E、CFU E)、粒单核系 (CFU GM)及巨核系 (CFU Meg)祖细胞培养 ,了解骨髓祖细胞增殖情况。方法抽取 4 7例AA患儿骨髓分别作四类祖细胞培养 ,在 7、14d测定其集落数。结果 4 7例AA患儿中 ,四类集落数均值与对照组比较均有显著下降 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) ,且四类集落数均值在AA三种类型中 ,基本上随病情加重均值逐步下降 ,其中四类集落数低于对照组下限的患儿分别为BFU E 36 .17%、CFU E 85 .11%、CFU GM 74 .4 7%、CFU Meg 91.4 9 %。BFU E、CFU GM和CFU Meg随着患儿疾病的加重 ,低于对照组下限的患儿百分比同步上升 ,且三者的表现与外周血三系表现一致 ,而CFU E却未见上述现象。结论在部分AA患儿中存在着四类祖细胞培养集落数的下降 ,且基本上与患儿病情成正比 ;BFU E的变化较CFU E更能代表患儿骨髓红系祖细胞的变化。     

人参总皂甙诱导人骨髓基质细胞表达GM-CSF的实验研究

目的：研究人参总皂甙(TSPG)对人骨髓基质细胞表达GM—CSF的影响及其与人粒单系血细胞发生的关系。方法：采用造血祖细胞与骨髓基质细胞体外培养、造血生长因子生物学活性检测、免疫细胞化学和核酸分子原位杂交等技术。结果：TSPG能显著刺激粒单系造血祖细胞(CFU—GM)增殖；经TSPG诱导制备的骨髓基质细胞条件培养液富含GM—CSF样活性；TSPG能显著促进骨髓基质细胞的GM—CSF蛋白和mRNA表达。结论：TSPG可能通过直接和/或间接途径促进造血诱导微环境中的骨髓基质细胞合成和分泌GM—CSF，进而促进CFU—GM的增殖分化。     

LY294002可抑制VEGF和PlGF调控小鼠胎肝造血干细胞髓系分化的作用

 【目的】探讨内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PlGF）对小鼠胎肝造血干细胞髓系分化的影响及其相关机制。【方法】体外培养E13胎肝造血细胞,培养造血集落CFU-GM,观察VEGF和PlGF对胎肝造血干细胞髓系分化的作用,应用MTT法来评估不同浓度的PI3-K/Akt抑制剂LY294002对胎肝造血细胞增殖的影响及其对VEGF和PlGF调控胎肝造血作用的影响, Western-Blot检测不同处理条件对胎肝造血细胞Akt蛋白以及p-Akt蛋白表达水平的影响。【结果】VEGF和PlGF均促进胎肝造血干细胞髓系分化,集落数分别为对照组的141%（P<0.05）和123%（P<0.05）;经PlGF处理的胎肝造血细胞后,p-Akt蛋白表达水平是对照组的143%（P<0.01）;VEGF和PlGF分别处理以及联合处理后,与对照组的总Akt蛋白表达水平相比,差异没有统计学意义。不同浓度的LY294002抑制胎肝造血细胞的增殖,并具有明显的剂量依赖性（r=0.9647,P<0.01）,LY294002可抑制VEGF和PlGF调控胎肝造血干祖细胞调控髓系分化的作用,集落数为单独存在时的11.5%（P<0.001）和14.5%（P<0.001）。【结论】VEGF和PlGF均能促进胎肝造血干细胞的髓系分化;PlGF可通过上调胎肝造血细胞Akt的磷酸化水平调节胎肝造血细胞的髓系分化。     

CD133~+人脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定

目的从人脐带血中分选出CD133+造血祖细胞,并进行长时间干性维持培养。方法通过免疫磁珠法分选出人脐带血中的CD133+造血祖细胞,经流式细胞仪检测免疫磁珠分选后的CD133+造血祖细胞。采用五种方法扩增培养该细胞,8周后,再通过细胞形态学、流式细胞术、免疫细胞化学和免疫荧光对细胞进行干性鉴定,探索最佳干性维持培养方法。结果通过免疫磁珠法可以从人脐带血中分选出80%以上的CD133+造血祖细胞。采用优化的无血清培养基培养8周之后,CD133+造血祖细胞可得到有效扩增。而其他的培养基会使CD133+造血祖细胞由半悬浮细胞分化为梭形贴壁细胞,并且细胞状态欠佳。结论利用免疫磁珠法分选出的CD133+造血祖细胞,采用优化的无血清培养基能够有效扩增该细胞,并可长期有效的维持其干性。     

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34+细胞造血

[目的]探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用.[方法]采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34 细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7～35 d,每星期取样检测细胞总数,用半固体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34 、CD34 CD38-细胞百分率.[结果]在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34 细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34 、CD34 CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4～5星期后均仍然可见.原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d后仍可见HPP-CFU集落形成.[结论]人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34 /CD34 CD38-细胞数也有一定程度的扩增作用.     

Inducing effects of macrophage stimulating protein on the expansion of early hematopoietic progenitor cells in liquid culture

Background Macrophage stimulating protein （MSP） is produced by human bone marrow endothelial cells. In this study we sought to observe its effects on inducing the expansion of early hematopoietic progenitor cells which were cultured in a liquid culture system in the presence of the combination of stem cell factor （SCF）, interleukin 3 （IL-3）, interleukin 6 （IL-6）, granulocyte macrophage-colony stimulating factor （GM-CSF）, erythropoietin （EPO） （Cys） and MSP or of Cys and bone marrow endothelial cell conditioned medium （EC-CM）. Methods Human bone marrow CD34^＋ cells were separated and cultured in a liquid culture system for 6 days. Granulocyte-macrophage colony forming unit （CFU-GM） and colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte （CFU-GEMM） were employed to assay the effects of different treatment on the proliferation of hematopoeitic stem/progenitor cells. The nitroblue tetrazolium （NBT） reductive test and hoechest 33258 staining were employed to reflect the differentiation and apoptosis of the cells respectively. Results MSP inhibited the proliferation of CFU-GM and CFU-GEMM in semi-solid culture and the inhibitory effect on CFU-GEMM was stronger than on CFU-GM. MSP inhibited the differentiation of early hematopoietic progenitor cells induced by hematopoietic stimulators. Bone marrow （BM） CFU-GEMM was 2.3-fold or 1.7-fold increase or significantly decreased in either Cys＋EC-CM, Cys＋MSP or Cys compared with 0 hour control in liquid culture system after 6 days. Conclusion MSP, a hematopoietic inhibitor, inhibits the differentiation of early hematopoietic progenitor cells induced by hematopoietic stimulators and makes the early hematopoietic progenitor cells expand in a liquid culture system.     

外周血造血干细胞最佳采集时机的快速判断方法

目的：探讨一种快速、简捷判断外周血造血干/祖细胞最佳采集时机的方法。方法:使用Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪上的未成熟细胞信息(IMI)通道，对5例异基因外周血造血干细胞移植(Allo-PBSCT)的健康供者,在动员过程中采集外周血进行外周血造血祖细胞（HPC）检测。同时应用流式细胞术(FCM)和集落培养法分别对上述外周血中的CD34+ 细胞、粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）进行分析，动态监测外周血造血干/祖细胞(HSC/HPC)的变化。结果：HPC与CD34+ 细胞及CFU-GM呈良好的正相关，相关系数分别为0.82和0.85。动员后第4天HPC与CD34+ 细胞和CFU-GM同时明显上升，于动员后第5天同时达到高峰，但HPC较CD34+ 细胞和CFU-GM变化幅度大（5~20倍）。结论：Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪能快速简便地动态监测外周造血干/祖细胞的变化，为外周血造血干/祖细胞最佳采集时机的判断提供了一种快捷经济的参考方法。     

骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达造血生长因子的实验研究

目的在分子生物学水平上探讨体外培养的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达TPO、GM-CSF、SCF的mRNA的能力的差异.方法收集培养28d的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞,采用RT-PCR方法在mRNA水平上分析其造血生长因子GM-CSF、SCF、TPO的表达,比较二者表达TPO、GM-CSF、SCF等造血生长因子的mRNA能力的差异.结果体外培养的人脐血基质细胞与骨髓基质细胞均能表达:(1)TPO的mRNA,人脐血基质细胞表达能力强于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为1.57;(2)SCF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.83;(3)GM-CSF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.68.结论人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可以表达造血生长因子TPO、GM-CSF、SCF的mRNA,具有支持调控造血的物质基础.     

当归注射液对免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞周期蛋白D2表达的影响

目的:探讨当归注射液对免疫诱导再生障碍性贫血(AA)小鼠骨髓有核细胞增殖周期及其细胞周期蛋白D2表达的影响。方法:雌性Balb/c小鼠,随机分为3组:①正常对照组:未经特殊处理。②模型对照组:经60Co6Gyγ-射线亚致死量全身照射,4 h内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴结混合细胞,制成AA模型,于制模当天即给予腹腔注射无菌生理盐水,每天10 ml.kg-1,连续12 d。③当归注射液组:每天予当归注射液10 ml.kg-1,腹腔注射,连续12 d。于第12 d每只小鼠称重后,采集尾静脉血测外周血白细胞计数,后断颈处死小鼠,取出双侧尺骨及股骨,冲出骨髓单个核细胞,计数。并行组织学切片,粒单系祖细胞培养及骨髓有核细胞G0/G1期细胞百分率及细胞周期蛋白D2的检测。结果:与正常对照组比较,模型对照组造血细胞明显减少,粒单系祖细胞计数明显减低,骨髓有核细胞G0/G1期细胞百分率明显增加,而细胞周期蛋白D2表达水平明显降低,当归注射液组能增加骨髓单个核细胞计数及粒单系祖细胞计数,明显降低G0/G1期细胞百分率,提高细胞周期蛋白D2的表达水平。结论:当归注射液可能通过刺激细胞周期蛋白D2的表达促进造血细胞的增殖。     

脐血CD_(34)~+细胞体外扩增的实验研究

目的　探讨脐血造血细胞体外扩增及其移植的最佳时期。方法　用免疫磁珠法分离纯化人脐血CD+34细胞 ,从CD+34细胞不同体外培养系中取样检测细胞总数、CD+34细胞百分率和CFC(包括CFU -GM和BFU-E)。结果　A组 (加rhSCF、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)与B组 (加rhFL、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)对各阶段造血细胞扩增效果无显著差异 ,C组 (加rhSCF、rhFL、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)各项结果均显著优于A组 (P <0 0 1)和B组 (P <0 0 1) ,rhCSF与rhFL有明显的协调效应 ;培养 7d时开始增多 ,培养 14d进入高峰 ,培养 2 1d开始下降 ,培养 2 8d明显下降。结论　C组能明显扩增人脐血造血细胞 ,培养 7～ 14d造血细胞达高峰 ,为移植最佳时间。     

再生障碍性贫血患者骨髓CFU-GM及血清细胞毒试验18例临床分析

目的 :探讨再生障碍性贫血 (简称再障 )的体液免疫抑制发病机理。方法 :对 18例再障患者 (急性再障 6例、慢性再障 12例 )进行骨髓CFU GM培养及血清细胞毒试验。结果 :16例骨髓CFU GM培养集落数明显低于正常对照组(P <0 0 1) ,15例存在有造血干细胞缺陷、细胞和体液免疫异常及微环境异常 ,病人血清经 5 6℃ 30min水浴灭活前后对正常骨髓CFU GM的刺激作用明显不一 ,而且在同属于造血干细胞缺陷的病例中急性再障与慢性再障比较也有显著性差异。结论 :骨髓CFU GM及血清细胞毒试验在对再障体液免疫抑制发病机理研究中起有协同作用。     

氧化应激对铁过载造血干祖细胞造血功能的影响

目的 体外诱导脐血来源的造血干祖细胞铁过载,检测参与氧化应激的活性氧物质(ROS)的水平以及对造血干祖细胞造血功能的影响.方法 通过体外培养脐血单个核细胞(MNC)的过程中添加枸橼酸铁铵(FAC),建立铁过载造血干祖细胞模型.实验分组:对照组、FAC组、FAC+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、FAC+谷胱甘肽(GSH)组.检测各组细胞内ROS水平,并用抗氧化剂处理,检验这一过程中ROS、细胞内可变铁池(LIP)、凋亡水平、造血集落形成和脐血各系造血细胞数目的变化.结果(1)在培养液中加入不同浓度FAC(50、100、200、400μmol/L)培养不同时间(6、12、24 h),发现ROS水平随着FAC的浓度和培养时间变化,且在200μmol/L FAC的培养液中培养24h时ROS水平达到最高.(2)用抗氧化剂(NAC、GSH)联合FAC处理细胞发现,抗氧化剂处理组细胞内总的ROS以及髓系细胞和红系细胞内的ROS明显低于FAC组(均P＜0.05).(3)在200 μmol/LFAC的浓度下,培养脐血MNC 24 h后细胞内总的LIP、髓系细胞和红系细胞内LIP水平均显著高于对照组(均P＜0.05),但抗氧化剂NAC和GSH对铁过载细胞内LIP没有明显影响.(4)对脐血造血干祖细胞造血功能的检测发现:FAC组细胞凋亡比例[(20.90±3.45)％]明显高于对照组[(9.20±1.29)％](P＜0.05);造血集落形成单位(CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix)计数明显低于对照组(前3项两组间差异具有统计学意义,P ＜0.05);CD34+、CD33+、GlyA+细胞比例及细胞计数均显著低于对照组(均P＜0.05);这些损伤都可以通过NAC或GSH处理部分恢复.结论 氧化应激在铁过载造血干祖细胞的损伤中扮演着重要角色,可以通过升高细胞内ROS水平抑制其造血功能,清除细胞内多余的ROS能减轻这些损伤.研究结果可为治疗铁过载患者因氧化应激诱导的造血功能低下提供新的靶点和研究思路.