预诱导与全反式维甲酸并脑源性神经营养因子体外诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞可定向诱导分化为神经元样细胞,但目前培养的方法尚不统一。 目的：采用预诱导与全反式维甲酸和脑源性神经营养因子为培养体系,拟在体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-12/2008-06在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠2只,由新疆医科大学动物试验中心提供。 方法：采用贴壁法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,经反复传代细胞逐渐纯化。取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞,按8×107 L-1密度接种后,改换含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子的神经干细胞培养体系进行预诱导,48 h后去除预诱导液,加入含10 μg/L脑源性神经生长因子、1 μmol/L全反式维甲酸的神经干细胞培养体系定向诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞。以未诱导的骨髓基质干细胞作为对照。 主要观察指标：流式细胞仪检测第3代骨髓基质干细胞表面标志的表达,诱导后免疫荧光染色和流式细胞仪检测巢蛋白阳性的表达,免疫荧光染色鉴定神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果：第3代骨髓基质干细胞CD29,CD44表达率分别为97.1%,99%,CD45表达率为0.5%,CD34呈阴性表达。预诱导48 h后巢蛋白阳性率为24%,而对照组仅为4.6%。诱导48 h后,巢蛋白染色呈阳性,并可见大量神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞出现;对照组均呈阴性表达。 结论：神经干细胞培养体系联合全反式维甲酸与脑源性神经生长因子,可在体外高效、稳定地诱导骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞,并进一步向神经元和神经胶质细胞方向分化。     

大鼠骨髓基质细胞超微结构观察及胶质源性酸性蛋白的表达

目的:体外分离培养大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),通过超微结构观察和免疫组织化学检测探讨细胞生物学特性。方法:收集幼年大鼠骨髓细胞,利用贴壁培养法纯化扩增。培养细胞至第3代,相差显微镜及苏木精-伊红染色,扫描电镜和透射电镜观察细胞生长状态和细胞形态;免疫细胞化学染色检测细胞表面神经标记物巢蛋白(Nestin),神经特异性烯醇化酶(NSE),胶质源性酸性蛋白(GFAP)。结果:电镜下细胞表面见大量微绒毛结构,一些细胞有单个或多个突起样结构。多数细胞膜完整,胞质内存在丰富的细胞器;胞核大而明显,染色质分布正常;细胞间连接较少,可见缝隙连接。免疫细胞化学检测GFAP阳性细胞为(15.05±3.92)%。结论:第3代BMSCs具有生长旺盛,增值能力强,分化程度低的特点;部分细胞可表达GFAP。     

携带神经干细胞肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活分化

摘要 背景：多项研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,肌基膜管具有良好的细胞、组织相容性和降解性,那么能否将二者结合起来构建一个新的神经组织工程支架？ 目的：以神经干细胞为种子细胞,以肌基膜管为支架,观察携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活与分化情况。 方法：体外分离培养大鼠神经干细胞,并进行鉴定。用化学萃取方法制作去细胞骨骼肌基膜管支架,将神经干细胞移植入肌基膜管支架培养7 d后,用免疫组织化学方法检测神经干细胞的存活及分化情况,扫描电镜观察其超微结构。 结果与结论：神经干细胞分离培养第5天,Nestin免疫荧光染色可见大量神经球。加血清诱导神经干细胞分化至7 d,进行抗NF、抗GFAP免疫荧光染色,镜下可见NF、GFAP阳性细胞,证明培养的神经干细胞具有多项分化潜能。苏木精-伊红染色法显示肌基膜管中肌细胞成分已消失,肌基膜管支架内主要是大致平行的管道。携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架免疫荧光染色证明,神经干细胞在支架内仍具有干细胞特性,并可分化为神经元和神经胶质细胞。扫描电镜显示神经干细胞可以稳固地贴附在肌基膜管内,提示制备的神经组织工程支架具有良好的生物相容性,可以进行体内移植治疗脊髓损伤等神经系统疾病。 关键词：肌基膜管;组织工程支架;神经干细胞;移植;脊髓损伤 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.003     

施万细胞和神经干细胞在PLGA支架中共培养的扫描电镜观察

目的 扫描电镜观察施万细胞和神经干细胞在生物可降解材料（乙交酯-丙交酯）共聚物（Poly（lactide-co-glycolideacid），PLGA）支架中的生长状态，探讨施万细胞、神经干细胞与PLGA取向支架的细胞亲和性。方法 体外培养大鼠神经干细胞和施万细胞，待细胞生长良好，移植接种至PLGA支架上，培养9d后行扫描电镜观察。结果 施万细胞与神经干细胞在PLGA支架表面贴附，形态正常，生长良好。迁出神经球的神经干细胞分化成多种形态的细胞紧贴PLGA表面。部分细胞形态类似神经细胞。结论 施万细胞和神经干细胞在PLGA支架中生长良好，PLGA对施万细胞及神经干细胞具有良好的细胞亲和性。     

Prdx6对神经干细胞增殖和分化的影响研究

目的探讨过氧化物氧化还原酶6(Prdx6)对神经干细胞的增殖和分化的影响。方法 (1)采用悬浮培养法从新生SD大鼠脑分离培养神经干细胞,传至第三代后进行神经干细胞特异性标记蛋白巢蛋白(Nestin)的免疫荧光检测;(2)细胞实验分组:溶媒组、Prdx6 1 ng/m L、10 ng/m L、100 ng/m L、1μg/m L组;(3)采用台盼蓝细胞计数法计数各组细胞培养第1 d、第2 d、第3 d、第4 d和第5 d的细胞数,并绘制细胞生长曲线;(4)细胞增殖实验观测各组细胞形成神经球的直径,用Cell Counting kit-8(CCK-8)试剂盒检测各组细胞在450 nm处的吸光度值;(5)在细胞分化实验中,通过免疫荧光染色检测神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞数。结果 (1)体外培养得到悬浮生长的神经干细胞,免疫荧光染色Nestin呈阳性;(2) Prdx6 100 ng/m L组和1μg/m L组神经干细胞形成神经球的直径、吸光度值,以及分化后的NSE、GFAP阳性细胞数与溶媒组比较,差异有统计学意义(均P 0. 05)。结论 Prdx6具有促进神经干细胞增殖和分化的作用。     

免疫磁珠法分离、培养人脑胶质瘤干细胞

目的建立免疫磁珠法分离，并培养人脑胶质瘤干细胞的方法。方法将术中取得的脑胶质瘤标本，通过剪切、消化和吹打成单细胞悬液，筛网过滤，免疫磁珠分选试剂盒分选出CD133^＋细胞，用神经干细胞无血清培养法培养出具有单细胞克隆能力的细胞球，取第3代进行诱导分化，分化前后用免疫细胞荧光化学方法鉴定肿瘤干细胞及分化后细胞。结果免疫磁珠分选出的CD133^＋细胞，可悬浮生长并形成神经干细胞样细胞球，有较强的增殖能力，干细胞标志物巢蛋白（nestin）阳性，分化后细胞表达神经元小管相关蛋白β-3（β-tubulin3）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白质（GFAP）特异性抗原，而巢蛋白、CD133^＋阴性，并具有肿瘤的核型。结论免疫磁珠分选法可避免原代培养中众多细胞混杂生长的发生，能够从大量肿瘤细胞中分离出只占极少比例的肿瘤干细胞，细胞结合磁珠后在体外可以长期培养和传代，进一步证实了肿瘤干细胞的存在，并为胶质瘤干细胞的研究奠定基础。     

不同来源人羊膜间充质干细胞的混合培养

背景：人羊膜间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞,但在培养过程中发现干细胞增殖的数量不足。 目的：为了获得足够数量的人羊膜间充质干细胞,观察人羊膜间充质干细胞混合培养的生长情况及经碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞向神经样细胞的分化情况。 方法：将两个不同胎盘来源的羊膜分离培养、混合,采用细胞分离和培养技术获取人羊膜间充质干细胞,分离人羊膜间充质干细胞后传代培养,加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化。当细胞传至第3代时,随机取培养的6份人羊膜间充质干细胞(半量)为A组,6份人羊膜间充质干细胞(半量)为B组,将A、B组各剩余的半量人羊膜间充质干细胞混合为C组。3组细胞浓度均为1.0×107 L-1。以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量,以免疫组织化学法检测羊膜间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。 结果与结论：混合人羊膜间充质干细胞之间有互相促增殖的作用。人羊膜间充质干细胞具有较强的可朔性,经碱性成纤维细胞生长因子诱导的人羊膜间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白。     

胚胎大鼠脑纹状体和中脑神经干细胞的培养

目的研究大鼠脑不同部位胚胎神经干细胞的增殖分化特性。方法采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的纹状体和中脑的神经干细胞,通过巢蛋白(nestin)表达和5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine BrdU)染色,鉴定细胞的增殖能力;通过新生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性免疫细胞化学染色,鉴定培养细胞的多潜能性。通过酪氨酸羟化酶的染色(tyrosine hydroxylase,TH)鉴定多巴胺神经元。结果二者在体外培养都可增殖成球,并能分化成神经系统3个谱系的细胞。纹状体增殖传代3个月,中脑培养细胞增殖维持3周。中脑干细胞分化TH阳性细胞比例高于纹状体。结论培养的胎鼠脑细胞是神经干细胞。纹状体干细胞增殖能力高于中脑干细胞,中脑干细胞更倾向于分化成TH阳性细胞。     

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景：随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径。但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题。 目的：拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成。 材料：14~16 d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供。 方法：取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖。原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定。应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况。 结果：原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应。以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达。 结论：实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 关键词：神经干细胞;体外培养;诱导分化     

bFGF和N2体外联合定向诱导骨髓间质干细胞向神经元样细胞分化

目的:将成年大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外定向诱导分化为神经元样细胞。方法:成年大鼠骨髓间质干细胞，进行体外扩增、纯化培养，对纯化后的MSCs，使用碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和神经培养添加剂N2进行诱导，使MSCs分化为神经元样细胞，并进行免疫细胞化学方法鉴定。结果：95．6％的MSCs出现形态改变，呈神经元样。免疫细胞化学法鉴定，显示神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)阳性表达。结论体外MSCs可以分化为神经元样细胞。     

神经干细胞向γ-氨基丁酸能神经元的诱导分化

目的探索海马神经干细胞在特定条件下分化成γ-氨基丁酸能神经元的情况,为颞叶癫痫的细胞替代学治疗奠定基础。方法新生大鼠海马组织中的神经干细胞在体外增殖后,加入特定的细胞因子进行诱导,使其向γ-氨基丁酸能神经元分化,对分化的细胞进行神经元烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白（MAP-2）、γ-氨基丁酸（GABA）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和半乳糖脑苷脂酶（GalC）免疫荧光染色鉴定,判断其分化成γ-氨基丁酸能神经元的情况。结果海马神经干细胞诱导贴壁后即发生分化,其中几乎全部分化成神经元（γ-氨基丁酸能神经元）,只有极少的胶质细胞和少突胶质细胞形成。结论从海马神经干细胞中几乎可以完全诱导形成γ-氨基丁酸能神经元,这为颞叶癫痫的细胞替代学治疗奠定了基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及分化为神经干细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,MSCs)体外分化为神经干细胞(neural stemcells,NSCs)的可能性。方法取4～6周SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养,通过传代得到纯化的MSCs后换用分化液诱导,通过形态学观察诱导后细胞形态变化,并用免疫荧光检测不同天数细胞nestin的表达率;NSCs分化实验对所诱导的NSC的分化潜能进行检测。结果MSCs诱导后的细胞nestin表达率随天数增加逐渐升高,1周后形成高表达nestin的神经干细胞球形细胞团;在含血清培养基中可自然分化为神经元和神经胶质样细胞。结论MSCs能于体外分化出神经干细胞,且具有进一步的分化能力,骨髓来源的神经干细胞将可能作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗。     

Growth and differentiation of neural stem cells in a three-dimensional collagen gel scaffold

Collagen protein is an ideal scaffold material for the transplantation of neural stem cells. In this study, rat neural stem cells were seeded into a three-dimensional collagen gel scaffold, with suspension cultured neural stem cells being used as a control group. Neural stem cells, which were cultured in medium containing epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor, actively expanded and formed neurospheres in both culture groups. In serum-free medium conditions, the processes extended from neurospheres in the collagen gel group were much longer than those in the suspension culture group. Immunofluorescence staining showed that neurospheres cultured in collagen gels were stained positive for nestin and differentiated cells were stained positive for the neuronal marker βIII-tubulin, the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein and the oligodendrocytic marker 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase. Compared with neurospheres cultured in suspension, the differentiation potential of neural stem cells cultured in collagen gels increased, with the formation of neurons at an early stage. Our results show that the three-dimensional collagen gel culture system is superior to suspension culture in the proliferation, differentiation and process outgrowth of neural stem cells.     

新生小鼠端脑组织神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的研究

目的探讨新生小鼠端脑组织神经干细胞是否能够分化成胆碱能神经元。方法取新生小鼠端脑组织．用无血清方法分离培养神经干细胞；用克隆培养的方法检验培养细胞的干细胞特性；用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）及干细胞诱导分化后神经元标志微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胆碱能标志胆碱乙酰转移酶（CHAT）；比较不同的诱导分化条件（5％胎牛血清、5％胎牛血清＋碱性成纤维细胞生长因子）对胆碱能神经元分化的影响。结果从新生小鼠端脑组织分离培养出具有自我更新、扩增能力的神经球；各培养基中神经球均为nestin阳性。诱导分化后均能够产生MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞以及ChAT阳性的胆碱能神经元。分化培养中加入碱性成纤维细胞生长因子能够提高胆碱能神经元分化的比例。结论新生小鼠端脑组织神经干细胞能够分化成胆碱能神经元。     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

人胚额叶皮层和海马干细胞的自主分化研究

目的 研究人胚胎额叶皮层和海马组织神经干细胞的自主分化特性。观察额叶皮层神经干细胞和海马神经干细胞特性的异同。方法 从人胚胎额叶皮层和海马组织分别分离提出神经干细胞，经无血清体外培养、扩增，形成神经球。神经球贴壁进行不加诱导剂的自主分化。采用细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记分裂增生的细胞，观察细胞的分裂增殖情况。免疫细胞化学法鉴定神经干细胞的自主分化能力，比较额叶皮层和海马神经干细胞的分化特点。结果 从人胚胎额叶皮层和海马分离的神经干细胞具有增殖能力，额叶皮层神经干细胞的细胞倍增时间为3．9d，海马神经干细胞的细胞倍增时间为3．2d。细胞贴壁分化后出现Nestin、GFAP、Tuj-1表达阳性的细胞。皮层和海马神经干细胞分化产生的Tuj-1阳性细胞分别是40．7％和19．3％；皮层和海马神经干细胞分化产生的GFAP阳性细胞分别是59．3％和80．7％。结论 分离培养的额叶皮层和海马神经干细胞具有自我更新和增殖能力，可以向神经元、胶质细胞分化。额叶皮层神经干细胞与海马神经干细胞的倍增时问、自主分化特点和分化为神经细胞和胶质细胞的比率各有不同。     

EGFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的建立增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。方法以质粒pEGFPNl转染培养第三代的大鼠胚胎中脑神经干细胞（mNSCs）,经G418筛选后,分别进行nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后ρ-Ⅲ-／ubulin、GFAP、CNPase免疫细胞化学鉴定。结果EGFP在基因转染12h后开始表达,24h后明显增加,48h达到高峰,经G418筛选1月后有阳性克隆形成,EGFP基因修饰不影响大鼠胚胎mNSCs的增殖与分化。结论成功建立EGFP基因修饰大鼠胚胎mNSCs,为进一步开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础。     

NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的建立神经生长因子β（NGFβ）基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。方法以质粒pcDNA3-hNGFb、pEGFPN1共转染大鼠胚胎中脑神经干细胞，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞内的表达，免疫细胞化学、Westernblot鉴定NGF-β在细胞内的表达。体外诱导分化，免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果GFP在基因转染12h后开始表达，免疫细胞化学、Westernblot结果表明NGF-β能在细胞中正确表达且NGF-β、GFP基因修饰不影响其增殖与分化。结论成功建立NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。     

星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的实验研究

目的探讨星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的影响。方法分离和培养新生大鼠脑组织的神经干细胞;采用差速贴壁法和振荡法分离纯化星形胶质细胞,用免疫细胞化学染色法,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞,进行细胞的纯度鉴定;将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,免疫荧光法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果纯化的星形胶质细胞GFAP抗体标记阳性,细胞纯度达98%;星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,NSE阳性细胞及TH阳性细胞明显多于对照组(P<0·05)。结论星形胶质细胞源性因子可快速诱导神经干细胞向神经元细胞、包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生。     

A population of human brain parenchymal cells express markers of glial, neuronal and early neural cells and differentiate into cells of neuronal and glial lineages

Glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positive cells derived from the neurogenic areas of the brain can be stem/progenitor cells and give rise to new neurons in vitro and in vivo. We report here that a population of GFAP-positive cells derived from fetal human brain parenchyma coexpress markers of early neural and neuronal cells, and have neural progenitor cell characteristics. We used a monolayer culture system to expend and differentiate these cells. During the initial proliferative phase, all cells expressed GFAP, nestin and low levels of betaIII-tubulin. When these cells were cultured in serum and then basic fibroblast growth factor, they generated two distinct progenies: (i) betaIII-tubulin- and nestin-positive cells and (ii) GFAP- and nestin-positive cells. These cells, when subsequently cultured in serum-free media without growth factors, ceased to proliferate and differentiated into two major neural cell classes, neurons and glia. In the cells of neuronal lineage, nestin expression was down-regulated and betaIII-tubulin expression became robust. Cells of glial lineage differentiated by down-regulating nestin expression and up-regulating GFAP expression. These data suggest that populations of parenchymal brain cells, initially expressing both glial and neuronal markers, are capable of differentiating into single neuronal and glial lineages through asymmetric regulation of gene expression in these cells, rather than acquiring markers through differentiation.