应用不同方法进行人牙髓细胞原代培养的比较研究

目的比较并建立人牙髓细胞原代培养的理想方法.方法分别采用组织块法、酶消化法和组织块消化法进行人牙髓细胞的体外原代培养,倒置显微镜及台盼蓝染色观察并比较三者的培养成活率、细胞活力、细胞形态和数量、培养耗时等,免疫组化法鉴定细胞来源.结果三种方法均可从人牙髓组织分离培养获得外胚间充质来源的牙髓细胞.组织块法耗时较长,4周能进行首次传代,传代成功率50%,细胞形态较单一;酶消化法能在较短时间内获得形态多样的人牙髓细胞,但培养成活率较低,且细胞数量较少,8天时传代成功率为20%;组织块消化法不仅培养成活率(75%)和8天传代成功率(62.5%)较高,而且在较短时间内可多量获得多种形态类型的人牙髓细胞.结论组织块消化法是一种更加科学可行的人牙髓细胞原代培养的优化方法,可为进行人牙髓干细胞的分离培养及特性研究提供实验方法学基础.     

牙髓细胞的原代培养方法探讨:冠部和根部牙髓的比较

目的 比较并建立冠部和根部牙髓细胞培养的理想方法一方法：自年轻、健康的人牙中取出完整牙髓，分别应用组织块法和组织块酶解法(0.1％I型胶原酶)对冠、根部牙髓进行原代细胞培养，通过对细胞培养成功率、细胞贴壁率和细胞活性的评估，确定用于根、冠髓细胞培养的理想方法一结果：组织块法比组织块酶解法具有较高的成功率．游出细胞具有较高的生长活性和较低的贴壁率.结论 在对根、冠髓细胞的原代培养中，组织块法优于组织块酶解法。本实验建立了冠、根部牙髓细胞原代培养的理想方法.     

改良组织块酶消化法培养人龋损牙髓干细胞的实验研究

目的:比较3种方法培养人龋损牙髓干细胞的成功率和细胞生长状态,以探求人龋损牙髓干细胞的最佳培养方法。方法:取18～22岁成人新鲜正常和龋损离体第三磨牙各25个,采用组织块法、酶消化法、改良组织块酶消化法培养牙髓干细胞。通过倒置显微镜观察组织块的贴壁以及细胞的形态和数量,并记录培养所需时间;有限稀释法纯化牙髓干细胞,流式细胞仪检测正常和龋损牙髓干细胞表面标记物Stro-1、CD 90的表达情况,绘制正常和龋损牙髓干细胞生长曲线。结果:组织块法、酶消化法和改良组织块酶消化法均可以培养出人龋损牙髓干细胞,其中改良组织块酶消化法可以在短时间内获得数量多,状态好,形态多样的细胞。通过有限稀释法获得的龋损牙髓干细胞生长速率高于正常牙髓干细胞(P<0.05)。结论:改良组织块酶消化法是一种较为理想的原代培养人龋损牙髓干细胞的方法。     

人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究

目的探讨组织块法、酶解组织块法和酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞的优缺点。方法分别应用组织块法、酶解组织块法及酶消化法进行人牙周膜细胞分离培养,鉴定细胞来源,利用倒置显微镜观察细胞生长状况。结果应用组织块法从24块人牙周膜组织中成功分离培养出人牙周膜细胞,成功率96%（24/25）,细胞生长状态良好;应用酶解组织块法成功率80%（16/20）;应用酶消化法成功率75%（12/16）。结论组织块法原代培养人牙周膜细胞方法简单且成功率较高。     

酶消化贴壁组织块反复消化法培养人牙周膜细胞

目的：牙周膜细胞原代培养成功率较低,探讨经济、高效的原代人牙周膜细胞培养方法,提高原代培养成功率及获得大量原代细胞一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一.方法：无菌刮出因正畸需拔出牙的牙周韧带,剪碎,用改良的酶消化-贴壁组织块-反复消化法培养细胞,MTT法检测其生长曲线,免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白,通过相差显微镜观察、骨分化诱导液诱导后用骨钙素免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色和钙结节染色方法对所获得的细胞进行鉴定.结果：所培养的细胞表达波形丝蛋白,骨分化诱导后碱性磷酸酶染色、骨钙素染色和钙结节染色均呈阳性.结论：改良的酶消化-贴壁组织块-反复消化法可获得大量的人牙周膜细胞.     

人牙龈成纤维细胞原代培养方法的比较研究

目的：建立和评价人牙龈成纤维细胞原代培养方法,并观察其生物学特性。方法：分别用组织块法、2种改良酶消组织块法培养人牙龈成纤维细胞（HGF）,用形态学、免疫荧光鉴定细胞来源。通过活细胞观察,MTT比色实验研究细胞体外生物特性。比较3种培养方法培养HGF的效果。结果：细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,符合人牙龈成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。组织块法、改良酶消组织块法（翻瓶法）、改良酶消组织块法（盖玻片法）的细胞培养成功率分别为26.7%、54%、60%。组织块法和2种改良酶消组织块法间的成功率差异有显著性（P〈0.01）,2种改良酶消组织块法间的成功率差异无显著性（P〉0.05）。结论：本实验建立的细胞系为人牙龈成纤维细胞。2种改良酶消化组织块法可显著提高人牙龈成纤维细胞原代培养成功率。     

人牙髓细胞体外培养的方法学研究

作者观察了组织块法和酶消化法以及DMEM和RPMI1640二种常用培养液在人牙髓细胞体外培养中的效果。结果表明，组织块法培养出的牙髓细胞为单一的成纤维细胞样细胞，用DMEM时，其传代成功率明显高于用RPMI1604；胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶联用可培养出成纤维细胞样细胞，少量的校形细胞和内皮样细胞，但细胞数量较少，生长缓慢，达不到传代要求。DMEM在培养板和组织培养瓶中均较适合牙髓细胞的生长，而RPMI1640效果不理想。提示组织块法和DMEM适合于人牙髓细胞的体外培养。     

离体培养人牙乳头细胞的消化法和贴壁法比较

目的：建立体外培养人牙乳头细胞的方法，比较酶消化法和组织块贴壁法对培养结果的影响。方法：分离合法堕胎的８月龄男胎的乳牙牙乳头组织，按Ａ、Ｃ区和Ｂ、Ｄ区将组织分成两组。一组用酶消化法获取细胞，即０．２％胰酶和０．０２％ＥＤＴＡ在３７℃下消化２０ｍｉｎ，另一组采用常规组织块贴壁法。结果：在酶消化法组中原代细胞按形态分为三种：梭形、星形纤维细胞样和内皮样。内皮细胞在贴壁培养组和继代的酶消化法组极少观察到。两种方法获得的细胞在传代和生长特性等方面相似。结论：酶消化法在来源组织丰富时是一种较好的原代培养方法，人牙乳头细胞在体外的成功培养将给人们研究该细胞提供一个重要的工具。     

人牙髓细胞体外培养的方法学研究

作者观察了组织块法和酶消化法以及ＤＭＥＭ和ＲＰＭＩ１６４０二种常用培养液在人牙髓细胞体外培养中的效果。结果表明，组织块法培养出的牙髓细胞为单一的成纤维细胞样细胞，用ＤＭＥＭ时，其传代成功率明显高于用ＲＰＭＩ１６４０；胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶联用可培养出成纤维细胞样细胞，少量地梭形细胞和内皮样细胞，钽细胞数量较少，生长缓慢，达不到传代要求。ＤＭＥＭ的培养板和组织培养瓶中均较适合牙髓细胞的生长     

两种方法培养人牙周膜成纤维细胞成功率的比较

目的探讨酶消化组织块法及传统组织块法培养人牙周膜成纤维细胞的成功率,并比较两种方法获得的细胞在形态学和生物学特性上的差异。方法分别采用酶消化组织块法及传统组织块法培养人牙周膜成纤维细胞各20份,观察细胞形态并通过免疫细胞化学染色法检测波形蛋白、角蛋白的表达情况,比较两种培养方法的成功率。结果酶消化组织块法成功率为65%,传统组织块法为30%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。两组细胞均以梭形为主,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。结论酶消化组织块法培养成功率高于传统组织块法。两种方法获得的细胞在形态学和生物学特性上无明显差异。     

山羊乳牙牙髓细胞分离培养与矿化诱导的体外研究

目的:分离培养山羊乳牙牙髓细胞,研究其矿化诱导前、后生物学特性的改变。方法:采用改良酶解组织块法培养山羊乳牙牙髓细胞,应用免疫组化方法(SAB法)对第2代细胞进行来源检测,经矿化诱导培养的第4代细胞与常规培养细胞做对照,进行相关生物学特性检测,包括细胞增殖能力、矿化能力、细胞形态改变、蛋白OCN表达、相关成骨基因(ALP、COL-I、OCN、OPN)表达水平。结果:改良酶解组织块法可较快地培养出山羊乳牙牙髓细胞,细胞爬出时间为培养的第3～4天。第2代细胞抗波丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证明其间充质来源。MTT法测定显示,未诱导细胞的增殖能力明显高于矿化诱导后的细胞。与未诱导细胞相比较,矿化诱导的细胞ALP染色、钙结节茜素红染色均呈强阳性,免疫组化OCN阳性表达。诱导14d后,定时定量PCR检测证实成骨基因OCN、ALP显著上调。结论:本实验采用改良酶解组织块法成功培养出山羊乳牙牙髓细胞;连续矿化诱导培养14d后,山羊乳牙牙髓细胞分泌矿化基质,具有向成骨细胞分化和形成骨组织的潜能。     

CM-DiI体外标记人乳牙牙髓干细胞的可行性研究

目的: 筛选CM-DiI用于人乳牙牙髓干细胞标记的最佳浓度,并对标记后细胞的生物学行为进行评价,为下一步细胞活体移植和体内示踪打下基础。方法: 酶解组织块法培养人乳牙牙髓细胞并纯化,免疫组化鉴定细胞来源,进行细胞体外多向诱导分化能力实验。将第3代细胞分别使用浓度2 mg/L、3 mg/L及4 mg/L的CM-DiI进行标记,比较标记后细胞乳酸脱氢酶释放率及细胞增殖情况,并观察经体外多次传代后细胞荧光的表达情况。结果: 酶解组织块法可获得成集落状生长的人乳牙牙髓细胞;免疫组化确定细胞为间充质而非造血来源;细胞具有成脂、成骨及成牙本质等多向分化能力。3种标记物浓度均未对细胞乳酸脱氢酶释放及细胞增殖产生显著的不利影响;随体外多次传代,标记荧光强度逐渐减退。结论: CM-DiI操作简便、染色速度快,可有效的标记人乳牙牙髓干细胞,其中3 mg/L的标记浓度细胞毒性极小,标记效率高,在体外多次传代后荧光信号仍能稳定表达。     

人牙髓细胞体外培养条件的优化

目的：优化体外人牙髓细胞（ＨＤＰＣ）培养条件，以提高ＨＤＰＣ原代培养成功率。方法：采用玻璃及塑料培养瓶、高糖ＤＭＥＭ以及标准型、合格型胎牛血清，分别比较原代牙髓组织细胞游出率。结果：塑料培养瓶细胞游出率以及细胞游出最短时间均明显优于常用玻璃培养瓶；两种不同型号胎牛血清比较为标准型胎牛血清的组织块贴壁以及细胞游出率均优于合格型胎牛血清；高糖ＤＭＥＭ适合于ＨＰＤＣ培养。结论：商品塑料培养瓶、标准胎牛血清、高糖ＤＭＥＭ是提高体外ＨＤＰＣ培养成功率的关键。     

模拟微重力对人牙髓干细胞微丝及细胞迁移能力的影响

目的:探讨模拟微重力对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)微丝及迁移能力的影响。方法:利用旋转培养系统(rotary cell culture system,RCCS)将HDPSCs分为常规对照组和微重力培养组,分别于4、12、24、48、72h行免疫荧光染色,观察微丝的变化;72h后,透射电镜观察微丝骨架变化及细胞迁移实验检测细胞迁移能力。结果:4h时即有粗大的微丝纤维束解聚,24～72h变得模糊,紊乱,且出现多向排列趋势;实验组细胞迁移数量少于对照组(P<0.05)。结论:人牙髓干细胞微丝在模拟微重力环境下发生改变,呈时间依赖性并使细胞迁移能力降低。     

Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques.

BACKGROUND: Cultured epithelial cells offer many potential clinical applications. There have generally been two techniques that have been used to cultivate oral keratinocytes, which include the direct explant technique and the enzymatic method. Little work has been done comparing these two techniques and their capacity to isolate and cultivate oral keratinocytes. Objectives: The objectives of this study were to (1) investigate the difference in the percentage of keratinocyte isolation between the direct explant technique and the enzymatic method of human gingival epithelial cell culture and (2) to examine the effect of age and sex of the subjects providing the tissue samples on (a) the success in cultivation and (b) the growth patterns of gingival keratinocytes. MATERIAL AND METHODS: Gingival tissue was obtained from healthy human subjects and was used for keratinocyte isolation using the direct explant technique or the enzymatic method. Epithelial cell cultures from each of the two culture techniques were selected randomly for flow cytometry analysis for cell expression of vimentin and cytokeratin. Growth rate assays were also conducted. RESULTS: The success rate for cultivation from the direct explant technique was higher (82%) than in the enzymatic method (57.9%). The success rate of both methods was not significantly associated with either age or sex of the subjects providing the tissue. From flow cytometry, the average percentage of cells that was positive to anti-pan cytokeratin was nearly the same for both methods at about 97%. It was noted that the cells from the enzymatic method gave significantly higher percentages of cells that were positive to anti-pan cytokeratin only. CONCLUSION: Both the direct explant technique and the enzymatic method can be used for isolating and culturing human oral keratinocytes. The direct explant technique appeared to be more successful in culturing human oral keratinocytes than the enzymatic method, although there were limitations found with both methods. The age and sex of the subjects providing the gingival samples did not appear to be a factor influencing the success rate in culturing the keratinocytes. However, contamination by oral microbiological flora from the gingival tissue samples remained an ever present problem. Further studies are needed in the investigation of clinical applications of these two epithelial cell isolation methods.     

牛肌腱胶原凝胶体在人牙髓成纤维细胞等原代培养中的应用

在铺有牛肌腱胶原玻璃培养瓶中进行人牙髓和牙周组织原代培养，牙髓和牙周组织的成功率分别为９／２１和５／１５，与不铺胶原的对照组（１／２１和０／１５）相比有显著差异（Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０５）。这可能是细胞特异的高亲和力受体与胶原结合，使两者成为一个整体，增加了组织块贴壁率和细胞培养的成功率。本研究提示牛肌腱胶原铺制技术可以大大提高人牙髓和牙周组织培养的成功率。