辐射抗性小鼠与其亲代差异基因的表达序列标签

目的寻找IRM-2小鼠体内存在的与辐射抗性相关的基因。方法提取IRM-2小鼠和其亲代小鼠脾细胞总RNA,利用mRNA差异显示技术挑选差异表达片段,对每一条差异带进行特异PCR扩增、克隆和测序。结果获得IRM-2小鼠独有而亲代小鼠均无的cDNA差异带75条,经测序获得52条差异cDNA序列。与GenBank基因库同源性比较,得到21条与小鼠已知基因不同源的表达序列标签（EST）。结论21条EST提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

IRM-2小鼠cDNA文库的全长cDNA序列分析

目的分析IRM-2小鼠全长cDNA文库的cDNA序列。方法根据IRM-2小鼠的21条EST,从IRM-2小鼠全长cDNA文库测定基于该21条EST序列PCR扩增的全长cDNA序列,通过与GenBank基因库同源序列信息比对,分析全长cDNA序列和性质。结果根据21对引物PCR产物的拼接,获得5条全长cDNA序列,与小鼠已知基因不同源,而且得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的性质。结论 5条全长cDNA序列提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

小鼠轻型肠型放射病肠上皮细胞差异表达基因的筛选研究

目的 筛选经辐射诱导后小鼠肠上皮细胞的差异或特异表达基因。方法 通过基因库检索和计算机分析，设计出较通用的5’端武断引物在基因库中其呈现几率要高出数倍到数十倍的4条5′端高同源mRNA差示引物，应用DDRT-PCR，测序凝胶电泳，放射自显影，分子杂交等方法，分析并筛选小鼠受12Gyγ射线全身照射后3h(R1组）和96h(R2组）肠上皮细胞差异或特异表达基因。结果 5′端高同源性引物mRNA差异结果显示，与正常比较，小鼠全身12Gy照射后不同时相的肠上皮细胞基因表达存在差异，从近8000条PCR扩增产物中，比较筛选出12个差异表达基因片段，RNA-blot杂交对11个辐射损伤情况下差异表达基因片段进行了鉴定，R1S1和R1S2差异基因片段在辐射损伤后3h的肠上皮细胞中呈特异性表达；R2S2和R2S5基因片段在辐射损伤后96h的肠上皮细胞中呈特异性表达，R2S1，R2S6和R2S8基因片段是假阳性差异表达基因片段；而R2S1，R2S4及R2S8用RNA-blot法检测不到表达，序列分析结果显示R1S1和R2S2在基因库中未见高同源的基因序列，与R1S1同源性最高（60.00%)的是一个源于大鼠输卵管特异性糖蛋白基因，R2S5与一种小鼠肌细胞钙离子信号传导分子有67.21%的同源性；R2S2高度同源于鼠源性肿瘤诱导蛋白p32(91.52%)；R1S2在基因库中未检测到同源基因，结论 证实高同源引物具有良好的代表性和呈现几率，并筛选和鉴定出与辐射诱导的肠上皮损伤和修复相关的一组差异或特异表达基因。     

铁反应元件结合蛋白2基因在抗性及敏感品系淡色库蚊中表达量的分析

目的 进行不同品系的蚊中铁反应元件结合蛋白2(IREBP2)基因表达量的分析.方法 根据二维电泳获得的肽段序列,设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在抗性及敏感品系蚊的表达水平差异.结果 成功扩增淡色库蚊IREBP2基因的片段,荧光定量PCR表明IREBP2基因在抗性品系中的表达量是敏感品系的10.27倍.结论 淡色库蚊的IREBP2基因可做为新的抗性检测及治理的基因靶标.     

PPARγ2诱导脂肪细胞分化相关基因的克隆及鉴定

目的 分离和克隆小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2（mPPARγ2)诱导脂肪细胞分化的相关基因。方法 在体外建立mPPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞分化成脂肪细胞模型基础上,采用mRNA差异显示技术分离、克隆PPARγ2诱导的脂肪细胞高表达或低表达的cDNA片段,再通过半定量RT－PCR证实。结果 经mRNA差异显示技术分离到20条差异显示片段,进一步对差异显示片段进行PCR扩增,T／A亚克隆及测序分析,与Gen Bank基因数据库比较后,得到8个已知基因,一条新基因序列,2个EST序列和7个新的EST序列。半定量RT－PCR结果显示UNR基因在PPARγ2诱导的脂肪细胞中表达上调,而凋亡抑制因子5（AP15）的表达则下调。结论 UNR基因的高表达和API5基因的低表达可能与PPARγ2诱导脂肪细胞分化有关。     

腭裂相关基因TTF-2转基因小鼠载体的构建及体外表达

目的扩增及克隆C57BL/6j小鼠titf-2基因并利用小鼠骨髓间充质细胞进行表达.方法从C57BL/6j小鼠肝脏组织中提取基因组DNA,用PCR从中扩增出titf-2基因片段.将titf-2基因片段插入载体pMD18-T中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体pBROAD3-mcs中,构建重组表达载体pBROAD3-mcs-titf-2,并转染小鼠骨髓间充质细胞进行表达.用羊抗鼠TTF-2多抗IgG对表达产物进行Western Blot签定.结果 DNA测序结果证实,获得titf-2基因片段,大小与理论值相符;Western Blot分析表明,表达出TTF-2约为4.2KDa大小的蛋白.结论成功扩增、克隆titf-2基因,并在小鼠骨髓间充质细胞中得到表达,为下一步建立titf-2转基因小鼠模型奠定了基础.     

Balb／c小鼠胚胎皮肤无瘢痕愈合相关基因cDNA文库构建

目的筛选、克隆Balb／c成年小鼠和小鼠胚胎皮肤的特异表达基因,构建成年小鼠和小鼠胚胎皮肤差异表达的cDNA文库。方法应用Trizol法抽提样本的总RNA,进一步获得mRNA,结合PCRcDNA合成法将合成的双链cD-NA产物与载体连接构建cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,菌液进行PCR扩增,筛选有插入片段cDNA克隆。结果成功地构建了Balb／c小鼠皮肤无瘢痕愈合相关基因差异表达的cDNA文库,从中挑取85个克隆进行菌液PCR分析,结果显示57个克隆得到300—9Kp插入片段。结论通过RT—PCR方法并合成双链cDNA是一种自微量总RNA中构建高特异性的差异表达cDNA文库的有效方法。cDNA文库的构建有助于筛选、克隆小鼠胚胎皮肤无瘢痕愈合相关的特异表达基因。     

转铁蛋白基因在三种淡色库蚊体内表达量的比较分析

目的进行不同品系蚊转铁蛋白基因表达量的分析。方法据二维电泳获得肽段序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在淡色库蚊抗性品系品系、敏感品系、现场采集品系蚊体内的表达水平差异。结果成功扩增淡色库蚊转铁蛋白基因片段,荧光定量PCR表明转铁蛋白基因在抗性品系蚊体内的表达量是敏感品系的13.52倍,现场品系是敏感品系的7.48倍。结论淡色库蚊转铁蛋白基因可做为新的抗性检测及治理基因靶标。     

PPARγ2诱导脂肪细胞分化相关基因的克隆及鉴定

目的分离和克隆小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2)诱导脂肪细胞分化的相关基因.方法在体外建立mPPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞分化成脂肪细胞模型基础上,采用mRNA差异显示技术分离、克隆PPARγ2诱导的脂肪细胞高表达或低表达的cDNA片段,再通过半定量RT--PCR证实. 结果经mRNA差异显示技术分离到20条差异显示片段,进一步对差异显示片段进行PCR扩增、T/A亚克隆及测序分析,与Gen Bank基因数据库比较后,得到8个已知基因,一条新基因序列,2个EST序列和7个新的EST序列.半定量RT--PCR结果显示UNR基因在PPARγ2诱导的脂肪细胞中表达上调,而凋亡抑制因子5(API5)的表达则下调. 结论UNR基因的高表达和API5基因的低表达可能与PPARγ2诱导脂肪细胞分化有关.     

IRE-BP 1基因在三种淡色库蚊体内表达量的比较分析

目的进行不同品系淡色库蚊铁离子应答元件结合蛋白1基因表达量的分析。方法据二维电泳获得肽段序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在淡色库蚊抗性品系、敏感品系、现场采集品系蚊体内的表达水平差异。结果成功扩增淡色库蚊铁离子应答元件结合蛋白1基因片段,荧光定量PCR表明该基因在抗性品系蚊体内的表达量是敏感品系的8.22倍,现场品系是敏感品系的5.17倍。结论淡色库蚊铁离子应答元件结合蛋白1基因可做为新的抗性检测及治理基因靶标。     

小鼠LIF编码基因的克隆与真核表达载体pcDNA3.1-LIF的构建

目的：通过克隆小鼠LIF编码基因,构建pcDNA3.1-LIF真核表达载体,为下一步建立转基因动物模型奠定基础。方法：采用ICR雌性小鼠子宫组织,提取总RNA,运用RT-PCR技术,扩增出小鼠LIF基因全长编码序列,采用同源重组方法构建具有新霉素抗性的小鼠LIF真核表达载体pcDNA3.1-LIF。结果：通过PCR获得了约612 bp大小的特异性cDNA片段。经核苷酸序列分析,扩增得到的片段与小鼠LIF cDNA序列同源性为100%。经PCR及酶切鉴定筛选阳性克隆菌,表明LIF编码序列正确连入pcDNA3.1载体中。结论：成功克隆了小鼠LIF编码基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-LIF。     

小鼠Hsp84真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建小鼠Hsp84基因真核表达质粒。方法：采用逆转录、热降落PCR方法，扩增BALb／c小鼠Hsp84基因片段。将其连人pMD18-T载体，筛选阳性克隆、测序验证。然后以重组T载体为模板，PCR扩增目的序列，插入真核表达质粒pcD—NA3.1中，转化大肠杆菌DH5α，通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和验证阳性重组克隆。结果：RT—PCR自小鼠脑组织中扩增出目的基因片段，克隆人pMD18-T载体后，测序结果证明为BALb／c小鼠Hsp84基因．插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致。结论：成功构建了小鼠Hsp84编码框全长的真核细胞表达质粒。     

含hTERT基因片段重组逆转录病毒的构建

目的构建含hTERT基因片段的重组逆转录病毒。方法采用RT-PCR法从人白血病细胞株K-562中扩增hTERT基因片段(1590~2540bp),亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN,构建重组质粒pLXSN-hTERT;用脂质体转染的方法将从重组质粒转入PT67细胞,G-418压力筛选获得含hTERT基因片段的重组逆转录病毒细胞克隆;0.22μm微孔过滤抗性克隆上清获得含表达hTERT基因的重组逆转录病毒;WesternBlot检测G-418抗性克隆的hTERT产物的表达。结果PCR扩增的hTERT基因片段与GenBank公布的序列相比仅有2个核苷酸差异,氨基酸序列完全一致;重组病毒的滴度为2.85×105PFU/ml;WesternBlot检测到含hTERT基因片段的重组病毒能够表达出一分子量为37kD的多肽。结论成功构建了表达hTERT基因片段的重组逆转录病毒,为进一步探讨内源性表达hTERT基因产物的树突状细胞能否激发特异性CTL的产生奠定了坚实的基础。     

胃癌及其癌前病变相关基因差异表达的研究

目的 探讨与人胃癌发生密切相关的基因片段。方法 本研究应用荧光mRNA差异显示技术分析胃癌（3例）、胃癌前病变（3例）和正常胃黏膜（3例），鉴别并分离差异表达的基因片段，进行PCR再扩增。将扩增的cDNA片段克隆后进行测序，测序结果提交GenBank，经BLAST软件检索进行同源性分析。应用生物信息学技术确定基因在染色体中的定位。结果 发现1个差异表达的cDNA片段，在胃癌组织和癌前病变中高表达，初一步定位于17号染色体，在GenBank数据库中与RP11-25705克隆高度同源，但其具体功能目前尚不清楚。结论 本研究发现的1个基因片段在胃癌组织和癌前病变中高表达，可能参与了胃癌的发病过程。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

小鼠胸腺增龄相关性基因的差异表达及其克隆

目的 小鼠胸腺增龄相关性基因差异表达研究及其克隆。方法 利用DDRT－PCR技术对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行分析,获得差异表达片段（ESTs)。进一步作Northern印迹分析并进行核苷酸测序。选取其中一个EST为探针,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆基因。结果 对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行DDRT－PCR分析,发现小鼠胸腺基因存在增龄相关性的表达差异,某些基因在1或10月龄胸腺内有选择性表达,某些基因仅有表达量的变化。共获得108个差异表达的ESTs,其中31个呈Northern印迹阳性,全部测序。经同源性分析,有14个ESTs与已知基因有较高的同源性,17个ESTs为新的cDNA片段。选取其中1个在1月龄鼠胸腺水平表达的EST,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆到1个与小鼠的LAF1转酮醇酶高度同源的1480bp片段。结论 小鼠胸腺内存在增龄性基因表达差异。据此差异所获得的胸腺差异表达基因可能参与胸腺衰老与萎缩过程。     

淡色库蚊抗药性相关基因--NYD-MLC2基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关基因NYD-MLC2的cDNA全长序列并鉴定其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因片段序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增NYD-MLC2基因3′、5′端,经对位拼接获得全长序列,并进行生物信息学分析;荧光定量PCR验证此基因在抗性和敏感品系的表达差异。结果:获得淡色库蚊NYD-MLC2cDNA全长序列,开放阅读框为630bp(GenBank/NCBIDQ140391),编码210个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-MLC2与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)一个未知功能的蛋白同源性最高,为91%;实时荧光定量PCR结果显示,NYD-MLC2在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的4.08倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因cDNA全长序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-MLC2与淡色库蚊溴氰菊酯抗药性相关,值得进一步研究。     

用DDRT-PCR分析烧伤创面愈合相关基因的表达

目的:比较烫伤后第5天创面组织与正常皮肤组织间基因表达的差异.方法:用差异显示逆转录PCR技术(DDRT-PCR)分析基因表达差异,将所有差异表达基因割胶回收并再扩增,用点杂交和Northern杂交进一步证实基因表达差异,克隆并测序部分差异表达片段,然后将DNA序列与Genbank作同源性比较.结果:在显示出的约12 000条DNA条带中获取差异表达基因片段289个.用点杂交对其中126个片段进一步分析,用Northern杂交证实了3个创面愈合中高表达基因片段,经序列测定和同源性分析证实,其中一个为纤溶酶原激活因子抑制因子2A,其余2个为新基因片段.结论:纤溶酶原激活因子抑制因子2A在创面愈合过程中有重要作用.     

小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆小鼠长型肽聚糖识别蛋白（PGRP—L）的PGRP结构域基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术。从Balb／C小鼠肝组织总RNA中扩增PGRP—L的PGRP结构域基因片段,将其克隆人pUCm-T载体,以PCR、酶切和测序进行鉴定。以PCR从含PGRP结构域基因的重组质粒中扩增目的基因片段,插入表达质粒pQE-30构建重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,诱导表达并纯化目的蛋白。结果RT—PCR扩增得到约500bp的基因片段,将其与pUCm-T载体连接构建成重组质粒prnPGRPd,其酶切图谱与计算机分析结果一致,该基因片段长518bp,序列与Genbank中相应基因序列相同。构建成重组表达载体pQE-PGRPd,在大肠杆菌M15中表达,表达产物主要存在于菌体裂解液上清中,为一相对分子质量约29000的可溶性蛋白。结论成功克隆并原核表达了小鼠PGRP—L分子PGRP结构域基因,为PGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

转铁蛋白与Bel-7402肝癌细胞耐药性关系的研究

目的 研究转铁蛋白与Bel-7402肝癌细胞耐药性的关系.方法 根据已知转铁蛋白序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测其在敏感Bel-7402细胞株、阿霉素抗性Bel-7402细胞株之间的表达水平差异.结果 成功扩增Bel-7402肝癌细胞转铁蛋白基因片段,荧光定量PCR表明转铁蛋白基因在阿霉素抗性Bel-7402细胞株的表达量是敏感Bel-7402细胞株4.83倍.结论 转铁蛋白基因对肝癌细胞的耐药发生发展存在一定的作用,可为研究肝癌耐药性的备选基因,以及为肝癌耐药性检测提供新的靶标.