The Research on Chimeric MHC-Ⅰ Gene Responsing to Allogeneic Dendritic Cells

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制.方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组).分别感染BALB/c 小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞.分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数.结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17％.单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P＜0.01).结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低.     

高表达IDO的树突状细胞抑制T细胞增殖的实验研究

目的:研究基因转染后高表达吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的树突状细胞(DC)对T细胞增殖的抑制作用,以探讨其在器官移植中排斥反应的作用.方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从腹膜炎小鼠的小肠组织中获取IDO全长cDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pTracer中.构建真核表达质粒IDO-pTracer,随后用LipofectamineTM 2000介导转染小鼠脾脏DC,分为未转染组、空载体转染组、IDO基因转染组和IDO基因转染并添加1-甲基色氨酸(1-MT)组,以混合淋巴细胞反应的方法检测转染后DC对同种异系T细胞增殖的作用.结果:克隆的小鼠IDO基因全长cDNA大小约1.3 kb,无碱摹突变,以构建的重组真核表达质粒IDO-pTracer转染DC后,混合淋巴细胞反应结果显示IDO基因转染组的刺激指数(SI)低于未转染组、空载体转染组及IDO基因转染并添加1-MT组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:成功构建了IDO基因的真核表达载体IDO-pTracer,且IDO基因转染DC具有抑制异系T细胞增殖的作用.     

移植途径对骨髓间充质干细胞调节小鼠心脏移植排斥反应的影响

目的 探讨不同途径注射骨髓间充质干细胞（BMSCs）对调节小鼠心脏移植排斥反应的影响。方法 BALB/c和C57小鼠分别作为供体和受体,建立颈部心脏移植模型,随机分为4组,每组12只,A组在移植成功后立即经移植心脏升主动脉注射C57来源绿色荧光BMSCs悬液30 μL（含1×106细胞）,B组同样时间点经移植心脏右心室腔内注射相同数量细胞,C组同样时间点移植心脏心肌内注射相同数量细胞,D组为空白对照组。移植后第7天各组处死4只小鼠,切取移植心脏,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞的存活情况,HE染色观察移植心脏的病理学改变,流式细胞学检测移植物浸润白细胞中巨噬细胞的比例,其余8只小鼠用来观察移植心脏的存活时间。结果 术后第7天,仅A组移植心脏内可见绿色荧光细胞,病理学检测发现A组排斥反应受到明显抑制,心肌间质内细胞浸润明显减少,局灶性的心肌细胞损害,B组和C组移植心脏间质内可见多灶性淋巴细胞浸润并伴有心肌细胞变性坏死,而D组小鼠心脏见满视野大量白细胞浸润,心肌结构消失,心肌坏死。流式细胞学检测发现A组移植心脏内巨噬细胞的比例明显高于其他3组,A组的心脏存活时间明显长于其他3组。结论 BMSCs能减轻心脏移植排斥反应,动脉途径注射优于静脉和心肌局部注射途径,其机制可能与骨髓间充质干细胞在移植心脏内存活时间以及巨噬细胞比例增加有关。     

制作C57小鼠烧伤模型时Meeh常数的取值研究

目的:研究制作C57BL/6小鼠烧伤模型时适于计算全身体表面积(BSA)的Meeh常数(k)值。方法:24只6～12周正常C57BL/6小鼠,雌雄各半,将其随机分为8AM组、4PM组和0AM组,每组8只。实验前3d在8AM、12N、4PM、8PM、0AM和4AM称小鼠体质量。测定每只小鼠的BSA实际值,并据此计算其k值。分别应用4个常用k值(9.1、9.5、10和11.4)计算出每只小鼠的BSA计算值。结果:24h内小鼠的体质量差别有统计学意义,4PM时最低,0AM时最高;4PM组小鼠k值大于8AM组和0AM组,差别有统计学意义(P<0.05);将小鼠常用k值与本实验所得3个时点的k值分别进行比较,除常用k值9.5与0AM组k值之间差别无统计学意义外,其余比较差别均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。使用小鼠常用k值计算出的BSA计算值和C57BL/6小鼠的BSA实测值之间的差值最大达到了BSA实测值的23.02%。结论:制作C57BL/6小鼠烧伤模型时可按实验时间选用不同的k值,8AM时k值宜为9.617,4PM时为9.802。     

Pbx1基因突变对小鼠脊柱形态的影响

目的：研究Pbx1基因突变对小鼠脊柱形态的影响。方法构建含有Pbx1基因突变的载体,通过微注射注入C57BL/6J小鼠胚泡中,获得的嵌合体小鼠中再筛选稳定含有Pbx1突变的生殖细胞,再培育成含有Pbx1突变的成鼠。成年小鼠的骨架用茜素红染色法染色并拍照。妊娠晚期的小鼠胚胎进行软骨阿尔新蓝染色,并拍照。利用Fisher精确概率法检验Pbx1突变对脊柱骨骼数量的影响。结果 Pbx1-/-小鼠与其同窝的Pbx1+/+野生型小鼠比较,中轴骨骼形态有更多的异常(P<0．001),95.0%的Pbx1-/-小鼠呈现出第6腰椎缺失,所有骶椎呈现融合, Pbx1+/-小鼠的表型介于Pbx1-/-和Pbx1+/+野生型小鼠之间。检查Pbx1-/-小鼠的胸椎,显示脊椎背表面第10至第12胸椎的裂缝发生率为66.7%明显高于野生型小鼠的6.7%(P<0．001)。在小鼠胚胎中,Pbx1+/-和Pbx1-/-小鼠表现为后骶椎骨缺失。结论 Pbx1基因影响小鼠脊柱的发育,对维持脊柱骨正常形态具有重要作用。     

H102对APP转基因小鼠突触相关蛋白表达的影响

目的:观察H102对APP转基因小鼠脑内超微结构-突触后致密区(PSD-95)和突触素表达的影响.方法:将16只APP转基因小鼠随机分为模型组和给药组,每组8只.并设同月龄同背景C57BL/6J小鼠为正常组.给药组侧脑室注射H102生理盐水溶液,正常组和模型组侧脑室注射等体积生理盐水,3 μL/d,注射30 d后行行为学检测即水迷宫测试,然后取出并固定脑组织,利用免疫组化及Western blot方法测定小鼠脑组织突触素、PSD-95及shank1的表达.结果:定位航行实验给药组APP转基因小鼠逃避潜伏期从第2天较模型组差异有统计学意义(P<0.05),较正常组从第3天差异无统计学意义(P>0.05);空间探索实验第三象限停留时间和跨越平台次数较模型组差异有统计学意义(P<0.05),较正常组差异无统计学意义(P>0.05).模型组皮质和海马出现突触紊、PSD-95及shank1表达减少;注射H102后突触素、PSD-95及shank1表达较正常对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论:H102对阿尔茨海默病(AD)治疗有一定的应用价值.     

榄香烯静脉输注浓缩液对G422小鼠神经胶质瘤疗效的实验研究

目的测定榄香烯静脉输注浓缩液小鼠体内实验抗肿瘤疗效。方法用CremophorEL作增溶剂配合丙二醇制成2%榄香烯静脉输注浓缩液。以静脉注射(40、20、10mg/kg)或腹腔注射(80、60、40mg/kg)途径给药,静脉给药组每天2次,腹腔给药组每天1次,连续给药5d进行榄香烯注射液动物脑瘤G422(颅内接种)模型抗肿瘤疗效实验。结果榄香烯静脉输注浓缩液体内对动物脑瘤G422(颅内接种)模型肿瘤生命延长率为:静脉给药方案:高剂量组为56·07%~59·16%,中剂量组为45·55%~47·98%,低剂量组为31·25%~38·22%,生命延长率比较明显;腹腔给药方案:高剂量组为12·0%~24·0%,中剂量组35·1%~37·0%,低剂量组为30·9%~36·1%。若以静脉给药80mg/kg,每天1次,连续10d给药,结果显示其生命延长率为52·60%~57·07%。结论榄香烯静脉输注浓缩液对小鼠神经胶质瘤G422(颅内接种)模型有一定的抑制作用。     

日本血吸虫尾蚴感染小鼠CD8α~-CD11c~+型树突状细胞对哮喘的抑制作用

目的:研究日本血吸虫尾蚴感染鼠CD8α-CD11c+型树突状细胞(DC)在抑制过敏性哮喘中的作用。方法:用磁珠分选方法纯化日本血吸虫尾蚴感染鼠及正常鼠DC亚群CD8α-CD11c+细胞。将20只BALB/c小鼠随机均分为4组,A组为过继转移日本血吸虫尾蚴感染鼠CD8α-CD11c+型DC并诱发过敏性哮喘组,B组为过继转移正常鼠CD8α-CD11c+型DC并诱发过敏性哮喘组,C组为单纯过敏性哮喘组,D组为生理盐水对照组。A、B组小鼠经尾静脉过继转移5×105个DC,1h后A、B、C3组均开始诱发哮喘。4周后处死小鼠,取小鼠肺组织进行病理学检查。结果:肺部病理学结果显示A组小鼠肺组织炎症明显减轻,支气管管壁基本光滑,支气管内无黏液分泌。B组、C组肺组织炎症反应严重,支气管管壁增厚,管内存在大量黏液。D组小鼠肺组织无炎症反应。病理评分结果A组高于D组,低于B、C组,差异有统计学意义(P0.05或P0.01),B组和C组的差异无统计学意义(P0.05)。结论:日本血吸虫尾蚴感染鼠CD8α-CD11c+型DC可明显抑制过敏性哮喘的发生。     

The Inhibitory Effect of CD8α-CD11c+ Dendritic Cells on Asthma in Schistosoma Japonicum Infected Mice

目的:研究日本血吸虫尾蚴感染鼠CD8α-CD11c+型树突状细胞(DC)在抑制过敏性哮喘中的作用.方法:用磁珠分选方法纯化日本血吸虫尾蚴感染鼠及正常鼠DC亚群CD8α-CD11c+细胞.将20只BALB/c小鼠随机均分为4组,A组为过继转移日本血吸虫尾蚴感染鼠CD8α-CD11c+型DC并诱发过敏性哮喘组,B组为过继转移正常鼠CD8α-CD11c+型DC并诱发过敏性哮喘组,C组为单纯过敏性哮喘组,D组为生理盐水对照组.A、B组小鼠经尾静脉过继转移5×105个DC,1h后A、B、C3组均开始诱发哮喘.4周后处死小鼠,取小鼠肺组织进行病理学检查.结果:肺部病理学结果显示A组小鼠肺组织炎症明显减轻,支气管管壁基本光滑,支气管内无黏液分泌.B组、C组肺组织炎症反应严重,支气管管壁增厚,管内存在大量黏液.D组小鼠肺组织无炎症反应.病理评分结果A组高于D组,低于B、C组,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),B组和C组的差异无统计学意义(P＞0.05).结论:日本血吸虫尾蚴感染鼠CD8α-CD11c+型DC可明显抑制过敏性哮喘的发生.     

新型创面胶对小鼠感染创面治疗效果的研究

目的 探讨含5%三氯生的新型创面胶对小鼠细菌感染创面的治疗作用.方法 检测金黄色葡萄球菌发光强度与细菌菌落数.将18只小鼠制备金黄色葡萄球菌感染创面模型后随机分为创面胶组、新型创面胶组和对照组,每组6只.观察3组金黄色葡萄球菌感染后不同时间细菌发光强度的变化、愈合创面组织学、计算皮肤全层薄/厚比,并记录创面愈合时间.结果 细菌发光强度与菌落数呈高度正相关(r=0.995,P<0.001).新型创面胶组处理3 h后不同时间细菌发光强度低于创面胶组(P<0.05).创面胶组和新型创面胶组皮下炎性细胞明显较对照组密度高.新型创面胶组创面愈合后皮肤薄/厚比与创面胶组比较差异无统计学意义(P>0.05),但两组均大于对照组(P<0.05);新型创面胶组创面愈合时间短于创面胶组(P<0.05).结论 新型创面胶能明显抑制金黄色葡萄球菌感染创面细菌繁殖、减少瘢痕形成,促进创面愈合,但可增加机体局部炎性反应.     

羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠L929细胞增殖的影响

目的:研究自制羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠肺成纤维细胞(L929)增殖的影响及其组织相容性.方法:用羧甲基壳聚糖(CMCS)与甘油磷酸盐(GP)互配,制备羧甲基壳聚糖温敏凝胶,22只小鼠分为正常对照组1只、空白对照组3只,2％凝胶组和5％凝胶组各9只.采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)分别测定质量浓度为50、10、2、0.4、0.08倍的羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对体外培养的L929细胞的增殖情况;分别将2％和5％的温敏凝胶植入小鼠皮下,于3、7、14d处死,常规组织切片,HE染色观察凝胶周围组织的炎症反应.结果:培养24 h～96 h,0.4倍及0.08倍浸提液组与阴性和阳性对照组的OD值差异有统计学意义(P＜0.05);培养48、72、96 h后,除50倍浸提液组外其余各实验组与阴性和阳性对照组的OD值差异有统计学意义(P＜0.05),其中0.4倍浸提液促细胞增殖作用最为明显;凝胶植入后前3d,实验组以急性炎症为主,随着时间的延长各实验组炎症细胞逐渐减少至消失.结论:羧甲基壳聚糖温敏凝胶对L929细胞有明显的促进作用,且具有良好的组织相容性,在牙周病治疗中具有潜在的应用价值.     

线形程序性坏死在不同肿瘤局部微环境中分布的初步观察

目的:观察肿瘤局部微环境对肿瘤细胞发生线形程序性坏死(LPPCN)的影响.方法:C57BL小鼠9只,结扎小鼠左后肢股动脉,注射B16单细胞悬液于左后肢(缺血组)和右后肢(对照组),构建B16F10小鼠黑色素瘤后肢缺血模型;C57BL小鼠10只,注射B16单细胞悬液于小鼠腹腔(腹腔组)和左后肢(后肢组),构建小鼠黑色素瘤生物力学模型;HE切片观察不同组间LPPCN分布的差别;免疫组织化学染色检测肿瘤组织基质金属蛋门酶(MMP)-2、MMP-9的表达.结果:LPPCN细胞百分率比较,缺血组高于对照组,后肢组高于腹腔组,差异均有统计学意义(均P＜0.01);MMP-2、MMP-9阳性细胞百分率比较,缺血组高于对照组,后肢组高于腹腔组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论:肿瘤局部缺氧和压力变化可以上调MMP-2、MMP-9的表达并诱导肿瘤细胞发生LPPCN.     

M2型巨噬细胞外泌体对小鼠自身免疫性肝炎的保护作用#br#

摘要：目的　探究M2型巨噬细胞来源的外泌体（M2 Exos）对刀豆蛋白A（Con A）诱导的小鼠自身免疫性肝炎（AIH）的保护作用。方法　采用IL-4（20 μg/L）刺激RAW264.7巨噬细胞24 h后提取M2 Exos并用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术和蛋白质免疫印迹对其进行鉴定;免疫荧光观察RAW264.7巨噬细胞对M2 Exos的摄取情况。将12只C57BL/6J小鼠随机分为PBS组、DiR-M0 Exos组、DiR-M2 Exos组和DiR染料对照组。Con A（15 mg/kg）注射完成1 h后通过尾静脉分组注射PBS溶液、DiR-M0 Exos（100 μg）、DiR-M2 Exos（100 μg）和DiR染料,活体成像技术观察Exos在AIH小鼠肝、脾、心、肺、肾、肠的分布情况。将20只C57BL/6J小鼠随机分为Control组（PBS溶液）、Con A组（15 mg/kg Con A）,M0 Exos组（15 mg/kg Con A+200 μg M0 Exos）和M2 Exos组（15 mg/kg Con A+200 μg M2 Exos）,每组5只。Con A注射完成12 h后处死小鼠,收集外周血和肝组织,全自动生化仪测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平;苏木精-伊红（HE）染色观察肝脏病理形态变化;实时荧光定量PCR（qPCR）检测肝组织肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-6的mRNA表达水平;流式细胞术检测肝脏巨噬细胞亚群变化情况。结果　成功诱导并分离了M2 Exos,可被RAW264.7巨噬细胞摄取;经尾静脉注射后,M2 Exos主要在小鼠肝脏和脾脏中蓄积。与Control组相比,Con A组小鼠血清ALT和AST明显升高（P＜0.05）,肝脏结构紊乱,肝细胞大片坏死,肝组织TNF-α和IL-6 mRNA表达升高（P＜0.05）,肝脏单核细胞来源巨噬细胞（MoMFs）的浸润增多（P＜0.05）。与Con A组相比,M2 Exos组小鼠血清ALT和AST水平显著下降（P＜0.05）,肝脏坏死明显减轻,肝组织TNF-α和IL-6 mRNA表达降低（P＜0.05）,肝脏MoMFs的浸润减少（P＜0.05）。结论　M2 Exos可对小鼠AIH起到保护作用,其作用机制可能与降低肝脏炎性细胞因子的表达及减少对MoMFs的招募有关。     

犀角地黄汤合方对DC激活ITP患者T细胞增殖分化的影响

目的 观察犀角地黄汤合方含药血清对树突状细胞（DC）激活T细胞增殖分化的影响及其对免疫性血小板减少症（ITP）的作用机制。方法 将10只雄性SD大鼠随机分为含药血清组和空白血清组,每组5只,分别使用犀角地黄汤合方和蒸馏水连续灌胃3 d,腹主动脉取血制备含药血清和空白血清。分选15例健康志愿者及8例ITP患者CD4⁺ T细胞,将荷载血小板抗原的DC与CD4⁺ T细胞共培养,采用随机数字表法分为对照组,模型组,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组。对照组为荷载血小板抗原的DC与健康志愿者CD4⁺ T细胞,模型组和犀角地黄汤合方低、中、高剂量组为荷载血小板抗原的DC与ITP患者的CD4⁺ T细胞,其中对照组和模型组加入大鼠空白血清,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组分别加入体积分数为5%、10%及20%大鼠含药血清。流式细胞术（FCM）检测CD4⁺ T细胞的增殖情况,各组调节性T细胞（Treg）和效应性T细胞（Teff）的比例以及CD4⁺ T表面程序性死亡受体-1（PD-1）的表达量;酶联免疫吸附试验检测各组细胞上清液中促炎因子白细胞介素（IL）-2、干扰素-γ（IFN-γ）、IL-17以及抑炎因子转化因子-β（TGF-β）、IL-10的表达量。结果 与对照组比较,模型组CD4⁺ T细胞增殖百分比、Teff细胞比例以及促炎因子IL-2、IFN-γ和IL-17升高（P<0.05）,Treg细胞比例、CD4⁺ T细胞表面PD-1表达量以及抑炎因子TGF-β、IL-10水平降低（P<0.05）;与模型组比较,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组CD4⁺ T细胞增殖百分比、Teff细胞比例依次降低,Treg细胞比例、CD4⁺ T细胞表面PD-1表达量和抑炎因子IL-10、TGF-β升高（P<0.05）,促炎因子IL-2的量降低（P<0.05）;与模型组相比,犀角地黄汤合方中、高剂量组IFN-γ和IL-17降低（P<0.05）。结论 犀角地黄汤合方尤其是高剂量组含药血清能够在体外调节ITP患者CD4⁺ T细胞的过度增殖分化及细胞因子的分泌,这可能是犀角地黄汤合方治疗ITP机制之一。