大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达

目的：提高以大肠杆菌为工程菌制备重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF-1）的产率。方法：依据大肠杆菌遗传密码子使用频率表，人工合成3条DNA单链，PCR拼接扩增出适于在大肠杆菌中表达的人IGF-1基因。将此基因克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入表达载体pBV220，诱导表达，表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，酶联免疫分析（ELISA）检测表达产物中rhIGF-1的含量。结果：经基因改造后．rhIGF-1主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中，其产率较改造前提高近4倍。结论：所构建的大肠杆菌偏嗜性人IGF-1基因可显著提高rhIGF-1的产率。     

Flag-p107真核表达载体的构建及其在ECA109细胞表达及鉴定

目的 构建N端含flag标签的p107的真核表达载体,及其在EC109细胞表达的鉴定.方法 设计引物在p107蛋白N端增加flag标签,通过PCR扩增获得3×flag-p107 cDNA片段,将此片段插入真核表达质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin中;再与质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin连接,将所得的融合基因进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用电转染将其转染至ECA109细胞中;利用Western-Blotting检测融合蛋白CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin的表达情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在ECA109细胞中表达.结论 成功构建真核表达载体CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin并建立了其在ECA109细胞的表达.     

pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的:通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3．1( )／GDF-5,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法:提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3．1( )载体,并进行酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA 3．1( )／GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSC,RT-PCR和免疫细胞化学检测GDF-5的表达。结果:重组质粒双酶切图谱显示有5．4 kbp和1．6 kbp两条带;测序结果与Genbank中的序列完全相同;转染后RT- PCR显示实验组有一219bp特异性条带,免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组均为阴性。结论:本实验成功构建pcDNA3．1( )／GDF-5真核表达质粒,转染小鼠MSC中有GDF-5表达,为进一步研究其在软骨发育机制和软骨骨组织工程领域提供了实验基础。     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141序列的克隆和表达载体构建

目的：构建人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（hPTHrP1—141）基因的表达载体。方法：提取人基因组DNA，PCR扩增PTHrP1—141基因，将其克隆入原核表达载体pQE-30Xa，构建重组表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141。结果：重组载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141经限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。结论：表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141构建成功。     

人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人脂联素（adiponectin）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出adiponectin蛋白进行鉴定。方法：从人皮下脂肪组织提取总RNA，确认其正确性后经RT-PCR扩增得到全长cDNA片段，此片段经纯化回收后克隆至pMD 18-T载体，经行DNA序列分析，进一步克隆构建到表达载体至pET-DEST42中，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达。结果：含重组adiponeetin质粒的大肠杆菌经0．4mmol／L的IPTG诱导6h后有高表达。结论：adiponeetin基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。     

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体,以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ,并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接,构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析,证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。     

TOPO克隆构建SARS-CoV M蛋白基因裂殖酵母表达载体及其稳定性

目的 利用TOPO克隆法构建SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母重组表达载体，并验证重组载体在宿主细胞中的稳定性。方法 运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术从SARS-CoV RNA中扩增出M蛋白基因,AT克隆构建出序列正确的pMD18-T-M重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-M载体上亚克隆出M蛋白基因，与裂殖酵母表达载体pNMT1-TOPO进行TOPO克隆,构建出重组表达载体pNMT1-M,转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性转化子后进行测序鉴定。将序列正确的pNMT1-M重组载体电转化入裂殖酵母TCP1菌株中,在EMM培养基中诱导表达,连续传代100代，在EMM+T培养基中验证其稳定性。结果 RT-PCR获得666 bp的片段,pMD18-T-M重组载体经测序验证序列正确；重组表达载体pNMT1-M经菌落PCR和测序鉴定均正确;重组裂殖酵母菌经诱导后，SDS-PAGE检测出了表达条带;重组表达载体连续传代后,未发现丢失现象。结论 成功地构建出了SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母表达载体，验证了其在裂殖酵母中能稳定地进行遗传,为下一步的表达优化、活性和功能研究垫定了基础.     

小鼠H—2D^d基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的：构建BALB／c小鼠H－2D^d基因的逆转录病毒表达载体。方法：采用反转录PCR从BALB／c小鼠脾细胞基因组中，扩增H－2D^d的编码基因，插入克隆载体pGEM-T中。经EcoR I和Xho I双酶切后，亚克隆法于逆转录病毒载体pMSCV的相应酶切位点，构建pMSCV-H2D^d重组表达质粒，并经双酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoR I和Xho I双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pMSCV。克隆H－2D^d的编码基因经序列测定证实，与献报道完全一致。结论：成功构建小鼠H－2D^d编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用及临床移植的基因治疗应用奠定了基础。     

双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较

目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。     

人骨形态发生蛋白—2基因的真核表达载体构建

目的;利用杆状病毒载体,构建可直接转染昆虫细胞Sf9的含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2)基因的重组穿梭载体（bacmidDNA),最终获得重组蛋白。方法：将编码包含hBMP-2 N-端信号肽,中间前肽以及C－端成熟肽共1188bp的cDNA片断,插入真核表达载体pFastBacl的多克隆位点,受控于pPolh启动子,构建成pFastBacl/hBMP-2重组转移载体。重组子转化大肠杆菌DH10Bac。转座后、挑选阳性菌落,提取bacmid DNA,经PCR鉴定后,以重组bacmidDNA转染Sf9细胞。收集重组病毒,扩大转染Sf9,表达产物行SDS－PAGE初步鉴定。结果：获得了含hBMP-2全长cDNA片段的重组bacmid DNA和重组病毒,经SDS－PAGE证实在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白,经激光密度扫描仪扫描显示分泌性蛋白表达量占细胞蛋白总量的35．6％。结论：利用杆状病毒载体成功构建了可用于直接转染昆虫细胞而无需同源重组的重组bacmidDNA,并在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白。     

人类U5·116 ku蛋白基因片段的克隆

目的:构建人类U5·116 ku基因全长真核表达质粒。方法:从HeLa细胞中提取总体RNA,一步法合成单链cDNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,扩增出人类U5·116 ku基因两段连续的序列,首先分别克隆至pTZ57R/T载体,两段序列连接成全长后再定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒。结果:RT-PCR法获得U5·116 ku基因两段连续的序列,长度分别为1672bp和1246bp,分别与pTZ57R/T载体连接后,选择合适的酶切位点再连接成全长序列,然后将全长序列和pcDNA3.1(-)真核表达载体进行连接、转化、酶切鉴定及序列分析后,证实pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒构建成功。结论:成功克隆了人类U5·116 ku的编码基因,并构建了其真核表达质粒pcDNA3.1(-)-U5·116 ku。     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法:利用PCR技术扩增人脂联素基因完全编码序列,选用Gateway原核表达体系,经过BP反应、LR反应两步反应,将PCR产物克隆入pET-DEST42质粒,构建融合表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达脂联素融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,NDSB201高效复性后,使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞,RT-PCR法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶转录水平的影响。结果:成功构建了表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,DNA序列测定结果与预期一致。IPTG诱导表达的融合蛋白经纯化后Western Blot鉴定具有人脂联素抗原性,并可使培养的肝细胞中葡萄糖-6-磷酸酶转录水平下降。结论:获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。     

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrV基因的克隆及应用

通过PCR从柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约840bp的目的片段,其中包括了长度为828bp的dnrV全长序列。将dnrV基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )及pET-28a( )中,在宿主菌BL21(DE3)中经IPTG诱导后表达,经SDS-PAGE电泳和Western blotting验证正确。进一步将dnrV和doxA基因克隆至链霉菌表达载体pYG505和pYG907并转化SIPI-1482,筛选得到的硫链丝菌素抗性转化子发酵实验证明两个基因的协同表达能提高柔红霉素的产量。     

人类Survivin基因的cDNA克隆及序列分析

目的：克隆Survivin基因的cDNA，为分子信标定量检测其mRNA提供模板标准物。方法：以国人胎脾为材料提取总RNA作为模板，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增并克隆Survivin cDNA，并将其重组到pUCl8质粒中，用双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：克隆的Survivin cDNA序列与Gene Bank中的该基因序列相比较仅有1个碱基出现差别，并导致编码相应氨基酸的改变。结论：成功构建了Survivin基因的cDNA克隆，为建立Survivin基因mRNA的定量检测方法奠定了基础。     

超抗原VEGF-SEA融合基因的克隆与表达

目的:构建血管内皮生长因子-葡萄球菌肠毒素A(VEGF-SEA)基因的原核表达质粒,获得VEGF-SEA融合蛋白。方法:制备VEGF-SEA基因片段,插入pET40b构建重组质粒pET40b-VEGF-SEA,经序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达蛋白的相对分子质量及表达形式,并对产物采用His·Bind Buffer kit试剂盒纯化。结果:获得VEGF-SEA基因片段长1130bp,经序列分析与预期完全一致,其表达出目的蛋白的大小约为66.2ku,以包涵体形式表达,经纯化,纯度达到90%以上。结论:表达载体pET40b-VEGF-SEA构建成功,VEGF-SEA融合蛋白获得高效表达,本实验为进一步研究VEGF-SEA蛋白的活性及其功能,探讨超抗原抑制肿瘤生长作用奠定了基础。     

Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及其表达特点

目的：构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒，并在Hela细胞中表达以研究蛋白的定位和分泌特点。方法：以pGEM—T—MYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC），并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2-N1上，得到pDsRed2-N1—mMYOC重组表达质粒，再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后用脂质体包埋转染法转染Hela细胞，进行荧光显微镜观察，并用Western Blot分析蛋白分泌情况。结果：经酶切和DNA序列测定，证实重组质粒构建成功，mMYOC基因能在Hela细胞中表达，并且蛋白只定位在细胞质中，经Western Blot分析，mMYOC蛋白不能分泌到培养液中。结论：成功构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pDsRed2-N1—mMYOC，并能有效表达，其表达的蛋白定位在细胞质，并且不能分泌。