增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构造和表达

逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志,为此,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）基因,并构建可表达ＥＧＦＰ的逆转录病毒载体ＬＧＳＮ,通过脂质体转梁和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞,用以分析对造血细胞标记ＥＧＦＰ基因的可行性,流式细胞术和荧光显微镜检测发现,ＥＧＦＰ病毒转录的ＧＰ＋ｅｖｎＡｍ１２细胞和Ｋ５６２细胞均可发出稳定的绿色荧光信号,阳性率可分别达９７％和８６％,聚合酶链反应分析显示ＬＧＳＮ转子细胞内有原病毒的整合,上述结果提示,作为新一代选择性标志,ＥＧＦＰ是适于研究对造血细胞基因转移与报告基因,对促进人类基因治疗的研究有重要意义。     

HIV-1慢病毒载体的构建及结构改造

前很多基因治疗实验中选择造血干细胞 (HSC)等非分裂期细胞作为靶细胞。常用病毒性载体为逆转录病毒和腺病毒载体系统[1,2 ] 。逆转录病毒只能转导分裂期细胞 ,腺病毒载体在体内不能实现目的基因稳定的长期表达 ,且反复应用容易引起免疫反应。来源于人类免疫缺陷病毒 1(HIV 1)的慢病毒载体由于可以感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点越来越受到人们的重视[3 ,4] 。我们成功构建了慢病毒载体的三质粒包装系统并重点对其中的转移质粒进行了改造 ,筛选出转导效率较高的慢病毒载体。材料和方法1　主要试剂　各种…     

内在核糖体进入位点控制多药耐药基因mdr1表达的研究

目的：观察内在核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）控制多药耐药基因ｍｄｒ１的表达能力。方法：以帽依赖性Ｈａｍｄｒ１载体为对照，利用ｐＳＸＬＣ／ｐＨａ系统构建依赖脑心肌炎病毒ＩＲＥＳ翻译的逆转录病毒载体ＨａＩＲＥＳｍｄｒ１（ＨａＩｍｄｒ１），脂质体转染法导入鼠源包装细胞ＧＰ＋Ｅ８６并获得长春新碱耐药细胞；用聚合酶链反应（ＰＣＲ）与流式细胞术（ＦＣＭ）检测ｍｄｒ１基因的转移与表达。结果：病毒生产细胞ＧＰ＋Ｅ８６／ＨａＩｍｄｒ１上清中逆转录病毒的滴度为２．０×１０５ｃｆｕ／ｍｌ，对长春新碱、柔红霉素与紫杉醇产生交叉耐药（２４～５２倍），而且具有多药耐药表型。ＰＣＲ证实ｍｄｒ１基因已稳定整合至ＧＰ＋Ｅ８６／ＨａＩｍｄｒ１细胞基因组；ＦＣＭ分析表明ＩＲＥＳ能引导ｍｄｒ１基因翻译成Ｐ糖蛋白而高效表达，程度略低于Ｈａｍｄｒ１对照。结论：ＩＲＥＳ可引导ｍｄｒ１基因进行有效的帽非依赖性翻译，ｍｄｒ１基因在双顺反子载体中可作为显性选择性基因用于基因治疗。     

hVEGF165基因转移对血管内皮细胞增殖及分泌功能的实验研究

血管内皮细胞 (ＶＥＣ)损伤是再狭窄的始动因素已为大多数学者所公认 ,因此 ,促进经皮腔内冠脉成形术 (ＰＴＣＡ)后ＶＥＣ的迅速修复并发挥其正常功能是预防再狭窄的关键。实验证明 ,血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)能预防实验性血管成形术后再狭窄[1,2 ] ,但对其机制知之不多。我们观察ＶＥＧＦ对兔主动脉ＶＥＣ增殖及分泌前列环素 (ＰＧＩ2 )和血栓素Ａ2(ＴＸＡ2 )的影响 ,为ＶＥＧＦ用于预防ＰＴＣＡ后再狭窄提供实验依据。材料和方法1　含ｈＶＥＧＦ165ｃＤＮＡ的质粒ｐＳＶＩ2 1由美国Ｂｏｓｔｏｎ大学惠赠 ,腺病毒载体ｐＡＣＣＭＶ·ｐＬ…     

用于造血干细胞基因治疗的逆转录病毒载体

造血干细胞是理想的血液疾患基因治疗靶细胞,具有整合功能的逆转录病毒是应用最广泛的基因转移载体。从莫洛尼小鼠白血病病毒衍生的逆转录病毒载体(MLV)对人造血干细胞转染效率低、不能长期稳定表达,已成为开展造血干细胞基因治疗的障碍。本文就提高基因转移效率、改进MLV载体特性和研究新的逆转录病毒载体等几方面的进展作一综述。     

重组人造血干细胞因子基因在人造血干／祖细胞的转移和表达

目的：拓展造血干细胞因子（ＳＣＦ）的研究和基因治疗途径。方法：利用基因重组技术，构建了编码可溶性人ＳＣＦ基因的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＳＣＦ，应用脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ基因转移法将重组质粒导入Ψ２和ＰＡ３１７病毒包装细胞，经Ｇ４１８选择性培养基筛选，获得产重组病毒的包装细胞ＰＡ３１７／ＳＣＦ，其病毒效价为（２．４～８．５）×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，继而感染人造血干／祖细胞。应用多聚酶链反应、ＡＰＡＡＰ免疫组化染色和化学发光－直接酶标法检测人ＳＣＦ基因在细胞中转移和表达。结果：逆转录病毒载体介导的ｒｈＳＣＦ基因在人造血干／祖细胞中获得有效转移和表达。结论：为进一步研究ＳＣＦ的生物学特性及开展干细胞移植等提供了一定的途径。     

应用IRES序列研究人FL与Tpo基因在转染HFCL细胞中的表达

目的　探讨应用内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）序列对逆转录病毒介导的人Ｆｌｔ３ 配基（ＦＬ）与血小板生成素（Ｔｐｏ） 基因在骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ中的表达。方法　利用基因重组技术将ＩＲＥＳ序列与ＦＬ和Ｔｐｏ 基因构建到逆转录病毒载体中,脂质体法将重组质粒ｐＬＦＴＳＮ 和空载体ｐＬＸＳＮ转染ＰＡ３１７细胞,经Ｇ４１８ 筛选。用抗性克隆培养上清感染ＨＦＣＬ细胞,ＲＴＰＣＲ和基因组ＤＮＡＰＣＲ分析ｍＲＮＡ的表达及基因组整合情况,ＣＦＵＧＭ 集落法和Ｔｐｏ 依赖株法测定生物学活性。结果　成功构建出含ＩＲＥＳ序列的ＦＬ与Ｔｐｏ 基因逆转录病毒载体,ｍＲＮＡ水平及基因组中整合有ＦＬ与Ｔｐｏ 基因,生物学活性测定表明转染的骨髓基质细胞同时分泌ＦＬ与Ｔｐｏ。结论　ＩＲＥＳ序列调控ＦＬ与Ｔｐｏ 双基因在骨髓基质细胞中同时独立表达,为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响奠定了基础。     

转导p16cDNA对Jurkal细胞的生长抑制作用

Ｐ16(ＭＴＳ1ＣＤＫＮ2)蛋白是细胞从Ｇ1期向Ｓ期转换的主要抑制因子,许多白血病细胞ｐ16基因缺失,尤其是急性Ｔ淋巴细胞白血病(ＴＡＬＬ),缺失率可达83%[1]。提示ｐ16基因与ＴＡＬＬ的发生、发展有关。我们构建了ｐ16的逆转录病毒载体,体外转导缺失ｐ16的Ｔ淋巴细胞白血病细胞株Ｊｕｒｋａｔ,以探讨ｐ16对Ｔ淋巴细胞白血病的治疗作用。材料和方法1　细胞培养　Ｊｕｒｋａｔ细胞由中国医学科学院基础医学研究所吴宁华教授惠赠,文献报道和实验均证明其ｐ16基因纯合性缺失,Ｒｂ基因正常表达[2]。双嗜性包装细胞ＰＴ67购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司…     

琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色与荧光片段自动分析检测IgH基因产物的比较

在Ｂ 细胞发育过程中 ,免疫球蛋白重链 (ＩｇＨ)经历一个复杂的基因重排过程 ,由此产生 3个可变的互补决定区 (ＣＤＲ) ,这 3个决定区由 4个相对保守的框架区 (ＦＲ)分开 ,ＣＤＲⅢＶ Ｎ Ｄ Ｎ Ｊ序列是可用于分子技术研究的特异性标志物。以ＦＲ1、ＦＲ2和ＦＲ3相应引物的ＰＣＲ扩增ＣＤＲⅢ和ＪＨ序列常用于Ｂ细胞瘤的诊断。ＰＣＲ产物的检测方法有许多 ,如琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色 (ＥＴＢ ＡＧＧＥ)、荧光片段自动分析(ＡＬＦ)、ＳＳＣＰ、杂合性分析等。本研究以新鲜的或冷冻保存的典型血液淋巴瘤病人的骨髓穿刺细胞为材料 ,其中包…     

人凝血因子Ⅷ cDNA 体外真核表达的初步研究

目的：建立人凝血因子ⅧｃＤＮＡ体外真核高效表达的体系。方法：将人ＦⅧＢ区大部分缺失（Δａ７６０１６３９）的ＦⅧｃＤＮＡ插入ｐＣＩ真核表达载体、ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶ载体和逆转录病毒载体ｐＭＳＣＶ，构建了５种表达框架，在体外转染和感染了多种靶细胞。结果：ｐＣＩⅧ在ＮＩＨ３Ｔ３细胞产生了低水平表达，而ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶⅧ和ｐＭＳＣＶⅧ系列分别在Ｈｅｌａ细胞和Ｂｏｓｃ２３逆转录病毒包装细胞中呈较高水平的表达。Ｂｏｓｃ２３细胞培养上清感染的ＮＩＨ３Ｔ３和３２ＤＣ不能有效地产生ＦⅧ。结论：在ＦⅧ体外表达及基因治疗的方案设计中，靶细胞的选择是一重要因素。     

人脐血和骨髓CD_(34)~ 细胞基因转移效率的比较研究

人脐血和骨髓ＣＤ34 细胞在相同实验条件下,基因转移效率是否相同尚未见报道。我们研究比较了干细胞因子(ＳＣＦ),白细胞介素(ＩＬ)3,ＩＬ6等联合应用对人脐血和骨髓ＣＤ34 细胞基因转移效率的差别,为基因治疗的临床应用提供实验依据。材料和方法1　细胞系　Ｇ418抗性包装细胞株ＰＡ317ＧＣＧＰＸＳＮ及检测病毒滴度用细胞株ＮＩＨ3Ｔ3,均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠。2　病毒上清的制备及病毒滴度测定　按文献[1]进行。3　基因转移　脐血9份,来自兰州市妇幼保健院健康产妇;骨髓9份,来自健康供者。将脐血和骨髓用Ｆｉｃｏｌｌ液(…     

逆转录病毒双顺反子策略有效转导和共表达ALDH1基因与mdr1基因的研究

目的研究含内在核糖体进入位点(IRES) 的逆转录病毒双顺反子载体介导的醛脱氢酶基因(ALDH1)与多药耐药基因(mdr1)转导和共表达.方法以携带ALDH1与mdr1基因的重组逆转录病毒双顺反子G1Na-ALDH1-IRES-mdr1(G1Na-AIM)为载体,电穿孔法转导双嗜型包装细胞PA317,长春新碱筛选;所得病毒生产细胞PA317/ AIM与单嗜型包装细胞GP+E86乒乓感染提高病毒滴度;以重组病毒上清转染K562细胞,应用聚合酶链反应(PCR)和Southern blot检测转移基因的整合,流式细胞术(FCM)及MTT分析基因表达,集落培养法测定转导效率.结果双嗜型病毒上清滴度达1.0×105cfu/ml.基因修饰细胞K562/ AIM经PCR 和Southern blot证实双基因稳定整合至基因组,对4-氢过氧化环磷酰胺(4-HC)及长春新碱(VCR)耐药 (提高3～10倍),FCM及集落法检测基因转导效率为62%～70%.结论逆转录病毒IRES双顺反子载体能引导不同类型的耐药基因有效共表达,可用于扩大耐药范围,进行体内显性选择.     

内部核糖体进入位点介导多药耐药基因1在人CD34^＋细胞中的表达

为了达到双耐药基因共转染以拓宽造血细胞耐药谱的目的,初步观察了内部核糖体进入位点(IRES)介导多药耐药基因1(MDR1)在人早期造血细胞中的表达效率.由脑心肌炎病毒IRES调控MDR1基因翻译的双耐药基因逆转录病毒载体pSF-DIM和相同启动子调控的MDR1单耐药基因逆转录病毒载体pSF-MDR1,包装后获得的双嗜性包装细胞PA317/pSF-DIM和PA317/pSF-MDR1病毒滴度分别为8×104和1.3×105cfu/ml.用其上清感染人脐血CD34+细胞,经FCM检测表明基因转导后单基因转导组和双基因转导组P-gp表达均有提高,分别为28.82%(荧光强度25.49)和10.92%(荧光强度9.48),但单基因转导组高于双基因转导组.因此,IRES成功地介导了MDR1基因在人早期造血细胞中的表达,为后续的试验奠定了一定的基础.但是,双基因转导组和单基因转导组MDR1表达差异的原因还需进一步研究.     

支持疗法配合脉络宁治疗重症银屑病21例

重症银屑病是指泛发性红皮病型 (ＧＰＥ)、泛发性脓疱病型 (ＧＰＰ)等影响患者生命体征、甚至危及患者生命的一类银屑病。该类疾病临床治疗多依赖于激素或免疫抑制剂[1] [2 ] ,且疗效不很确切。近年来 ,我们应用支持疗法配合脉络宁治疗此类银屑病 2 1例 ,取得较好疗效。现分析总结如下。资料与方法1 1 一般资料2 1例患者均为我院住院病人 ,均为男性 ;年龄最大62岁 ,最小 1 8岁 ;2 1例患者中 ,单纯ＧＰＥ1 2例 ,单纯ＧＰＰ2例 ,ＧＰＥ伴ＧＰＰ2例 ,ＧＰＥ伴ＰＰＰ(局限性脓疱型 ) 3例 ,ＧＰＥ伴ＰＰＰ伴Ｐ(关节病型银屑病 ) 1例 ,ＧＰＥ伴…     

逆转录病毒载体介导入凝因子因子Ⅷ的体外高效表达

目的建立逆转录病毒载体介导的人凝血子因子Ⅷ（ＦⅧ）体外高效表达体系。方法将－Ｂ区缺失（７６０ａａ－１６３９ａａ）的人ＦⅧｃＤＮＡ（ＦⅧＢＤｃＤＮＡ）克隆至逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建了重组表达载体ｐＬＮＣ－ＦⅧＢＤ。经ＰＡ３１７细胞包装后,感染多种靶细胞。分别采用一期法、ＥＬＩＳＡ法和ＲＴ－ＰＣＲ检测细胞培养上清中人ＦⅧ的凝血活性（ＦⅧ：Ｃ）和抗原含量（ＦⅧ：Ａｇ）以及细胞中ＦⅧＢＤ ｃＤＮＡ的     

凝集素辛和电泳—免疫印迹法检测甲胎蛋白变异体

甲胎蛋白 (ＡＦＰ)是一个公认的肝细胞癌 (ＨＣＣ)标记物。然而 ,部分慢性肝炎、肝硬化等良性肝病亦可合成少量ＡＦＰ。由于糖基化过程的差异 ,不同疾病状况下肝细胞分泌的ＡＦＰ在糖链结构上并不相同。为了鉴别ＡＦＰ是产生于恶性肝癌细胞还是良性肝病细胞 ,人们已建立多种ＡＦＰ糖链变异体测定方法。新近的报告表明 ,ＡＦＰ糖链变异体测定还有助于ＨＣＣ复发转移的监测和预后的判断[1,2 ] 。我们在已建立的凝集素亲和免疫电泳自显影法[3 ] 的基础上 ,又建立了操作更简便、敏感度更高的凝集素亲和电泳 免疫印迹法 ,并初步用于良恶性肝病的…     

酶联免疫吸附夹心法检测血小板活化因子

检测血小板活化因子(ＰＡＦ),现用得较多的有生物法和物理学方法。因生物法缺乏特异性,物理学方法价格昂贵,操作繁琐,90年代以来,国外开始用放射免疫法检测ＰＡＦ[1]。我们试用酶联免疫吸附试验(ＥＬＩＳＡ)双抗体夹心法检测ＰＡＦ,报告如下。一、材料和方法1材料:本院正常献血本科生和附属医院肾小球肾炎病人血浆标本各20份。ＰＡＦ标准品、鸡卵清蛋白为Ｓｉｇｍａ产品,辣根过氧化物酶(ＨＲＰ,上海华美生物工程公司),硼氢化钠等为国产分析纯试剂。ＤＧ3022Ａ酶标仪。96孔酶标板。2ＰＡＦ抗体和酶标ＰＡＦ抗体制备和鉴定:(1)参照文献改良制…     

导入外源MGMT cDNA增加K562细胞对尼氮芥的耐药性

骨髓抑制是限制氯乙基亚硝脲类药物(CENUs)化疗剂量的关键因素。本实验以K562细胞作为骨髓细胞的转基因模型,把人MGMT cDNA构建到逆转录病毒载体并转导K562细胞,观察细胞在转导前后的MGMT基因表达水平及其对尼氮芥[1-(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl-3(2-chloroethyl)-3-nitrosourea,ACNU]耐药性的变化。结果表明转导细胞K562-MGMT~ 的MGMT基因表达水平有显著的提高,对ACNU的耐药性也较转导前的K562细胞有大幅度提高。实验提示,用基因转移的方法使骨髓细胞大量表达MGMT基因,有可能增加骨髓细胞对CENUs的耐药性,防止CENUs引起的骨髓抑制。     

葡萄糖代谢显像对恶性淋巴瘤临床分期和疗效评价

近年来 ,应用单光子发射计算机断层显像 正电子放射计算机断层显像 (ＳＰＥＣＴ ＰＥＴ)进行1 8氟 氟代脱氧葡萄糖 (1 8Ｆ ＦＤＧ)代谢显像从分子水平上反映肿瘤组织中的生化变化和代谢状态 ,对淋巴瘤的临床分期、疗效评价、放化疗后复发或残留肿瘤的诊断具有重要作用。我们将在我院进行1 8Ｆ ＦＤＧ代谢显像的 8例非霍奇金淋巴瘤 (ＮＨＬ)患者进行总结 ,报告如下。资料和方法1　临床资料　 1999年 5月～ 2 0 0 1年 8月在我院进行1 8Ｆ ＦＤＧ代谢显像的 8例ＮＨＬ患者中 ,男 5例 ,女 3例 ,年龄 2 4～ 73岁。所有患者均经手术或活检证实。…     

用于造血干细胞基因治疗的逆转录病毒载体

造血干细胞是理想的血液疾患基因治疗靶细胞,具有整合功能的逆转录病毒是应用最广泛的基因转载体。从莫洛尼小鼠白病毒衍生的逆转录病毒载体（ＭＬＶ）对人造血干细胞转染效率低、不能长期稳定表达,已成为开展造血干细胞基因治疗的障碍。本文就提高基因转移效率、改进ＭＬＶ载体特性和研究新的逆转录病毒载体等几方面的进展作一综述。