胎兔皮肤创伤消减文库构建与瘢痕愈合基因的初步筛选

目的:许多哺乳动物的胎儿在妊娠期前2/3内皮肤创伤为无瘢痕愈合,其发生机制至今尚不完全清楚。应用抑制性消减杂交获得差异表达的片段并构建消减文库,为差异基因的筛选及可能出现的未知基因的功能研究提供前期铺垫。方法:选择孕20d的胎兔及孕兔分别在腰部做全层皮肤切口,12h后取材作为胎兔创伤(fetaltrauma,FT)、胎兔对照(fetalcontrol,FC)和成兔创伤(adulttrauma,AT)。提取总RNA,合成dscDNA,经RsaⅠ酶切、Adaptor连接,两次杂交及两次抑制性PCR可获得差异性表达的片段。将扩增产物插入T载体并转染工程菌,培养后挑选阳性克隆。结果:经逐步验证获得61个较为可靠的阳性克隆。结论:设计并应用改良的SSH(2Drivers)替代传统的SSH,经实验证实在理论及实际操作上均可行且合理。消减文库的构建对无瘢痕愈合相关基因及其功能的后续研究提供了可靠的材料。     

兔皮肤组织无瘢痕愈合相关基因克隆中应用改良多重抑制性消减杂交技术的可行性

背景：传统的抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)主要用来比较两组mRNA样品中仅在一组表达的基因克隆。在兔皮肤组织无瘢痕愈合相关基因的克隆与筛选过程中，既要同时考虑到创伤与对照间的差异，又要考虑到胎兔与成年兔之间的差异。目的：获得可信的无瘢痕愈合相关基因，为从根本上认识无瘢痕愈合的发生机制提供极具现实意义的前期铺垫。设计：设立对照的实验研究。单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所。材料：选用42只体质量2．5～3kg健康的大耳白雌兔(第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)。干预：为了减少因遗传背景带来的干扰，实验设立了3组：胚胎创伤(Fetal trauma，FT)、胚胎对照(Fetal Mcontrol，FC)和成年兔创伤(Adult trauma，AT)；使用自行改良的一个检测子(Tester)对应两个驱动子(Driver)改良的多重SSH技术。主要结局观察指标：①RNA抽提结果。②SSH结果。结果：分别以胚胎创伤、成年兔创伤及胚胎对照为Fester，其余两个共同为Drivers，共获得正反向杂交产物3组，由全层皮肤组织抽提的总RNA具有较好的完整性，经PCR验证分析，G3PDH的消减效率令人满意。结论：自行改良的多重抑制性消减杂交技术在理论与实际操作方面都是可行的，尤其是从采用这种方法获得的差减库中筛选得到的阳性克隆更接近目的基因。     

创伤后无瘢痕愈合与BU581985基因片段表达的相关性研究

目的：利用原位杂交技术将BU581985基因片段在胎兔皮肤定位。方法：组织切片标本取自20d胎龄的胎兔背部全层皮肤切割伤后12h皮肤组织，基因片段。BU581985由作者构建的差减文库经筛选获得的阳性克隆菌。在巢式引物存在下将该阳性克隆菌扩增，纯化后以地高辛标记做原位杂交。结果：创伤胎兔的皮下及真皮组织中大量的成纤维细胞(胞浆及胞膜)呈现阳性反应。结论：胎兔皮肤成纤维细胞某些基因的表达有助于无瘢痕愈合的形成。     

兔皮肤组织无瘢痕愈合相关基因克隆中应用改良多重抑制性消减杂交技术的可行性

背景:传统的抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)主要用来比较两组mRNA样品中仅在一组表达的基因克隆。在兔皮肤组织无瘢痕愈合相关基因的克隆与筛选过程中,既要同时考虑到创伤与对照间的差异,又要考虑到胎兔与成年兔之间的差异。目的:获得可信的无瘢痕愈合相关基因,为从根本上认识无瘢痕愈合的发生机制提供极具现实意义的前期铺垫。设计:设立对照的实验研究。单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所。材料:选用42只体质量2.5～3kg健康的大耳白雌兔(第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)。干预:为了减少因遗传背景带来的干扰,实验设立了3组:胚胎创伤(Fetaltrauma,FT)、胚胎对照(Fetalcontrol,FC)和成年兔创伤(Adulttrau-ma,AT);使用自行改良的一个检测子(Tester)对应两个驱动子(Driver)改良的多重SSH技术。主要结局观察指标:①RNA抽提结果。②SSH结果。结果:分别以胚胎创伤、成年兔创伤及胚胎对照为Tester,其余两个共同为Drivers,共获得正反向杂交产物3组,由全层皮肤组织抽提的总RNA具有较好的完整性,经PCR验证分析,G3PDH的消减效率令人满意。结论:自行改良的多重抑制性消减杂交技术在理论与实际操作方面都是可行的,尤其是从采用这种方法获得的差减文库中     

创伤后无瘢痕愈合与BU581985基因片段表达的相关性研究

目的:利用原位杂交技术将BU581985基因片段在胎兔皮肤定位。方法:组织切片标本取自20d胎龄的胎兔背部全层皮肤切割伤后12h皮肤组织,基因片段BU581985由作者构建的差减文库经筛选获得的阳性克隆菌。在巢式引物存在下将该阳性克隆菌扩增,纯化后以地高辛标记做原位杂交。结果:创伤胎兔的皮下及真皮组织中大量的成纤维细胞(胞浆及胞膜)呈现阳性反应。结论:胎兔皮肤成纤维细胞某些基因的表达有助于无瘢痕愈合的形成。     

瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础。方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成。从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A)+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750bp,符合预期的文库构建要求。结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法：采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取100个白色克隆用茵落PCR进行鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论：用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

构建中国汉族人亚健康状态肾阴虚证的DNA消减文库

目的：采用抑制性消减杂交技术构建汉族人亚健康状态肾阴虚证DNA消减文库。方法：实验于2004—02在南方医科大学南方医院糖尿病分子实验室完成。样本来源于南方医科大学南方医院汉族亚健康且中医辨证为肾阴虚证的患者1例及健康自愿者1名作为其对照组。用硅胶法抽提血白细胞DNA，用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库。结果：用抑制性消减杂交方法筛选出了亚健康肾阴虚证的差异DNA片段，得到680个白色克隆，随机调取96个白色克隆，再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒91个，从而成功地构建了亚健康肾阴虚证的DNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆亚健康肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的：运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法：选择2004—08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例．符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断，肝肾功能正常，无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA，用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U／A载体连接，经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒，构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量；基因组DNARsaⅠ酶切产物；消减杂交产物扩增结果；蓝白斑筛选阳性克隆；聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果：用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段．基因组DNA经过RasⅠ酶切消化后．所得DNA片段主要集中在200～2000bp；消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后，产物明显增多，内含数条隐约可见的条带．主要集中在0．2～1．5kb；蓝白斑q互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆，结果正向消减杂交产物得到286个克隆．反向消减杂交产物得到262个克隆；随机挑取92个阳性克隆，经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段，大小为200～1000bp，从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法：选择2005—08／10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例，另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA，用SMART（Switch Mechanism At 5 end of RNA Template）技术逆转录并扩增总cDNA，用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果：TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高（A260nm/A280nm。〉1．90），用SMART技术扩增微量RNA，扩增产物双链cDNA主要分布在0．5～10kb，基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段，得到了480个白色克隆，再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

构建中国汉族人亚健康状态肾阴虚证的DNA消减文库

目的:采用抑制性消减杂交技术构建汉族人亚健康状态肾阴虚证DNA消减文库。方法:实验于2004-02在南方医科大学南方医院糖尿病分子实验室完成。样本来源于南方医科大学南方医院汉族亚健康且中医辨证为肾阴虚证的患者1例及健康自愿者1名作为其对照组。用硅胶法抽提血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库。结果:用抑制性消减杂交方法筛选出了亚健康肾阴虚证的差异DNA片段,得到680个白色克隆,随机调取96个白色克隆,再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒91个,从而成功地构建了亚健康肾阴虚证的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆亚健康肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的:运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法:选择2004-08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例,符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断,肝肾功能正常,无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒,构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量;基因组DNARsaI酶切产物;消减杂交产物扩增结果;蓝白斑筛选阳性克隆;聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果:用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段,基因组DNA经过RasI酶切消化后,所得DNA片段主要集中在200～2000bp;消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后,产物明显增多,内含数条隐约可见的条带,主要集中在0.2～1.5kb;蓝白斑α互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆,结果正向消减杂交产物得到286个克隆,反向消减杂交产物得到262个克隆;随机挑取92个阳性克隆,经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段,大小为200～1000bp,从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

无瘢痕愈合中核糖体蛋白s29基因表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用

目的：探讨核糖体蛋白s29基因(RPs29 gene)表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用。方法：采用抑制性消减杂交(suppression subtraetive hybridization，SSH)方法筛选并克隆鼠胚皮肤特异表达的RPs29基因cDNA片段。应用PCR技术扩增RPs29基因ORF全长，构建真核重组表达载体pcDNA3．1／RPs29，体外转染成鼠皮肤成纤维细胞，观察细胞形态结构改变，免疫组织化学方法、RT-PCR分析外源基因表达情况。结果：RPs29基因在成纤维细胞中表达，细胞增生能力降低，凋亡加剧。结论：核糖体蛋白s29基因表达产物能抑制成纤维细胞增生，促进细胞凋亡，为无瘢痕愈合的研究提供实验材料及实验依据。     

狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法:选择2005-08/10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例,另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNATemplate)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果:TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高(A260/A280nmnm>1.90),用SMART技术扩增微量RNA,扩增产物双链cDNA主要分布在0.5～10kb,基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段,得到了480个白色克隆,再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

新生大鼠脊髓损伤后再生相关基因文库构建及EST筛选

目的：分析新生大鼠损伤后再生时运动皮层神经元基因表达变化以探讨相关的再生机制。方法：新生大鼠脊髓双侧半横断后即刻单侧胚胎脊髓移植，术后3天用抑制性消减杂交技术筛选大鼠双侧运动皮层神经元差异表达基因，构建差减cDNA文库，通过蓝白斑实验和cDNA斑点杂交验证差异表达基因真阳性克隆，测序分析。结果：发现25个全新的EST片段，在GenBank中登陆并获得注册。结论：新生大鼠皮层神经元轴突中断后的再生过程中有基因表达变化，变化的基因可能与神经元再生有关。     

瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础.方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成.从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A) RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减库.结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750 bp,符合预期的库构建要求.结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减库,该库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据.     

多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库的构建及初步筛选

目的比较肺炎链球菌多重耐药株与敏感株标准参考菌之间的差异基因。方法使用抑制性消减杂交技术构建多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库,经斑点杂交筛选阳性克隆后对部分DNA片段进行测序和同源分析。结果成功的构建了肺炎链球菌多重耐药株差异DNA消减文库,经斑点杂交的初步筛选,有17个仅能与多重耐药株DNA探针杂交,而不能与敏感株DNA探针杂交。对这17个克隆片段测序及基因库检索分析,发现2个未知新序列。结论从全基因角度研究肺炎链球菌多耐药菌株与标准菌株基因组DNA分子遗传差异,为发现、克隆肺炎链球菌多重耐药相关基因提供依据。     

人直肠腺癌消减杂交差异片段的生物信息学分析

目的探测人直肠腺癌发生和发展过程中差异表达的基因片段,了解人直肠腺癌的分子生物学机制。方法应用抑制性消减杂交技术,获得人直肠腺癌差异表达的基因,用生物信息学cDNA文库筛选的方法,对人直肠腺癌cDNA消减文库中的差异基因片段的序列作预测和分析。结果用抑制性消减杂交技术随机挑取获得的阳性克隆,提取质粒,双酶切分析,进行序列测定,得到与直肠腺癌发病相关的差异基因片段-9cDNA(Genbank登录号为BM360862),用cDNA文库筛选得到一个全长cDNA序列。基因表达系列分析(SAGE)显示除了直肠腺癌外、9cDNA还分布于前列腺腺癌、脑干成神经管细胞瘤、胰腺腺癌、胚胎正常血管内皮细胞、脑室管细胞瘤。结论直肠腺癌的发病是多环节和多步骤的过程,9cDNA与直肠腺癌发病相关,对9cDNA基因差异片段进一步研究,将为了解直肠腺癌发病的特异相关基因奠定基础。     

无瘢痕愈合中核糖体蛋白s29基因表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用

目的探讨核糖体蛋白s29基因(RPs29gene)表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用。方法采用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)方法筛选并克隆鼠胚皮肤特异表达的RPs29基因cDNA片段。应用PCR技术扩增RPs29基因ORF全长,构建真核重组表达载体pcDNA3.1/RPs29,体外转染成鼠皮肤成纤维细胞,观察细胞形态结构改变,免疫组织化学方法、RT-PCR分析外源基因表达情况。结果RPs29基因在成纤维细胞中表达,细胞增生能力降低,凋亡加剧。结论核糖体蛋白s29基因表达产物能抑制成纤维细胞增生,促进细胞凋亡,为无瘢痕愈合的研究提供实验材料及实验依据。     

抑制性消减杂交技术及其应用研究进展

抑制性消减杂交是结合抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法 ,具有特异性高、假阳性率低、操作简便、灵敏度高等特点。在正常和异常状态下基因的表达变化、差异基因的克隆和鉴定对新基因的认识和基因表达调控有着重要意义。SSH在心血管疾病、肿瘤等方面的研究中取得了重要进展