牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因的克隆表达与纯化

目的 克隆表达牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)牙龈素中黏附素区域的Hgp44基因,并纯化目的蛋白.方法 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,克隆得到PgATCC33277的Hgp4基因,插入到克隆载体pMD18-T中并测序鉴定.经过酶切后将目的基因片段与表达载体pET22b相连,构建出表达质粒pET22b-Hgp44.将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹法进行分析.用固定化金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化.结果 目的基因片段约为1100 bp,与预期大小相符,测序结果与GenBank中ATCC33277国际标准菌株的RgpA的等位基因序列U15282一致.IPTG诱导后的菌体经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后形成一个以包涵体形式存在的44 000的融合蛋白.蛋白质印迹法检测证实其具有免疫原性.用镍离子金属螯合层析柱纯化出了目的蛋白,最后得到约3.5 mg/L的目的蛋白.结论 成功克隆表达了PgHgp44基因,并纯化出了目的蛋白.     

牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域（RgpAcd）基因,并将其置于大肠杆菌中作融合表
达。方法 利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉单胞菌RgpAcd,然后插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片段插入原核表达载体pET-15b来构建表达质粒pET-15b/RgpAcd。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后的菌体经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一个相对分子质量为5×104的融合表达蛋白产生。结论 本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌RgpAcd基因,并在大肠杆菌中表达了RgpAcd蛋白,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达

目的:构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子,转化于大肠杆菌BL21中,并在最适宜条件下诱导表达。方法:以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基因组DNA为模板,利用PCR技术获得目的基因PAD,将扩增得到的PAD基因定向插入线性克隆载体PMD18-T Vector中,得到克隆重组子PMD18-T-PAD。经PCR和双酶切鉴定正确的克隆重组子PMD18-T-PAD与表达载体PET-28a经Xhol和Ncol双酶切后,在一定连接体系下,连接构建表达质粒PET-28a-PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒PET-28a-PAD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋白。以抗His Tag单克隆抗体为一抗,Western免疫印迹鉴定。结果:DNA测序结果表明,PAD与NCBI核酸数据库中收录的PAD序列同源性达100%;37℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,250r/min振摇培养6h的诱导条件下,PAD可高效表达。结论:本实验成功构建了PAD的克隆表达重组子,并在大肠杆菌中表达了PAD蛋白,为进一步研究PAD的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌不同毒力株基因差异的比较研究

目的比较牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pgingivalis）高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277之间的差异基因。方法采用抑制消减杂交技术（SHH）对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277的基因差异。以高毒力株W83为被检菌，低毒力株ATCC 33277为参考菌，将提取的基因组DNA用内切酶Rsa Ⅰ酶切，连接特殊设计的接头进行两次消减杂交和PCR扩增，得到消减混合物，与TA克隆载体连接，转化到JM109中，建立消减文库，经PCR筛选鉴定阳性克隆，进而对部分片段进行测序和同源分析。结果经SSH筛选鉴定得到36个片段大小为88～372bp的阳性克隆基因片段。结论从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异，为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选及今后牙周病预防、诊治的靶标提供依据。     

敲除牙龈卟啉单胞菌菌毛次要组分FimCDE的载体构建

目的：构建重组质粒pPHU281-C-Spec-E,用于敲除菌毛蛋白次要组分基因fimCDE。构建fimCDE缺陷的牙龈卟啉单胞菌,为进一步研究FimCDE在感染中的作用奠定基础。方法：厌氧罐培养牙龈卟啉单胞菌菌株 ATCC 33277,提取基因组DNA后,PCR扩增获得含有人工设计的酶切位点的fimC基因的上游片段及fimE的下游片段,将其克隆到自杀质粒pPHU281内,命名为pPHU281-C-E;再将抗大观霉素的抗性基因插入到C及E片段之间,最终获得重组质粒pPHU281-C-Spec-E。结果：酶切及DNA序列分析验证重组质粒pPHU281-C-Spec-E构建成功。结论：成功构建了含有牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白次要组分基因fimC上游及fimE下游片段的重组质粒pPHU281-C-Spec-E,可用于构建菌毛蛋白次要组分FimCDE缺陷的的突变体。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白,以抗6×His Tag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白A参与诱导小鼠牙槽骨吸收

目的探讨牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白(Fim)A是否参与该菌引起牙槽骨吸收的作用。方法用牙龈卟啉单胞菌ATCC33277野生菌株感染BALB/c小鼠,建立其诱导的牙周病动物模型。用ATCC33277及其fimA基因敲出的牙龈卟啉单胞菌KDP150变异菌株分别感染实验动物BALB/c小鼠(每组5只小鼠),测量其牙槽骨的改变情况,且与未接种细菌的阴性对照组相比较,采用t检验进行统计学分析。结果 ATCC33277组小鼠牙槽骨吸收量高于阴性对照组(P0.05),而fimA基因敲除菌株KDP150与对照组相比较,牙槽骨吸收量差异无统计学意义(P0.05)。野生菌株组小鼠牙槽骨吸收量高于fimA基因敲除菌株组(P0.05)。结论牙龈卟啉单胞菌fimA可能是该菌引起牙槽骨吸收的重要毒力因子。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因的克隆及表达纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因并使其在大肠杆菌中正确表达。方法利用PCR方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建其原核表达质粒pT-BAD/fimA,获得其在大肠杆菌中的表达,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定重组蛋白。以不同质量浓度咪唑缓冲液（250、200、150、100、50 μmol·L-1）洗脱结合在His-tag纯化柱的目的蛋白,选择最佳洗脱质量浓度。结果克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;诱导表达后可观察到相对分子量3.8×104的融合蛋白,经MALDI-TOF-MS检测进一步证实为FimA蛋白。100 μmol·L-1咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度最高,其纯度为95%。结论本实验成功克隆了fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到纯度较高的FimA蛋白,为后续研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌合成环二腺苷酸的高效液相色谱-串联质谱法定性分析

目的 定性检测牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）是否能产生细菌信号分子环二腺苷酸（c-di-AMP）,为探索其在P. gingivalis生命代谢以及牙周炎免疫中的作用奠定基础。方法 以P. gingivalis标准菌株ATCC33277为实验菌株,抽提细菌内核酸物质作为样品,配置c-di-AMP标准品,通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）对样品进行验证。结果 HPLC-MS/MS检出限按照信噪比（S/N）3∶1计算,c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49 min,P. gingivalis提取物样品在保留时间为8.82 min时有目标峰出现（大于3 S/N）。HPLC检测结果表明,P. gingivalis核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在15.7 min处出现目标峰,且二者的紫外吸收光谱相同。结论 牙龈卟啉单胞菌核酸提取物中含有c-di-AMP,牙龈卟啉单胞菌可以合成产生c-di-AMP。     

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡差异表达mRNA的生物信息学分析

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)W83与ATCC33277外膜囊泡mRNA表达谱的差异.方法 超速离心法分离W83和ATCC33277来源的外膜囊泡,进行粒径检测、电镜及Western blot鉴定;高通量测序检测W83和ATCC33277外膜囊泡mRNA表达谱,筛选差异表达的mRNA,进行基因本体...     

特定序列寡核苷酸MT01对牙龈卟啉单胞菌感染的成骨细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的 通过观察MT01对感染状态下成骨细胞细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,探讨MT01对牙周致病菌感染的成骨细胞生物学性能的影响。方法 以人成骨细胞MG63为目的细胞,分别与PBS、MT01、CpG ODN、甲硝唑和庆大霉素共培养3 h后,按感染复数100∶1的比例加入牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌共培养,检测培养24 h和48 h后MG63细胞的增殖、细胞周期及凋亡,以PBS作为空白对照,以牙龈卟啉单胞菌和PBS共培养作为阴性对照。结果MT01+牙龈卟啉单胞菌组细胞增殖高于空白对照组（P<0.05）,G₁期细胞百分比低于阴性对照组,而S期细胞百分比高于阴性对照组（P<0.05）,细胞早期凋亡率低于阴性对照组（P<0.05）。结论 MT01可促进感染状态下成骨细胞的细胞增殖,降低G₁期细胞百分比,促使细胞进入S期并抑制细胞早期凋亡。     

牙龈卟啉单胞菌双组分信号转导系统的研究进展

牙龈卟啉单胞菌被认为是主要的牙周致病菌之一,与慢性牙周炎发生发展密切相关。面对复杂的口腔环境,牙龈卟啉单胞菌必须及时感知环境变化并作出反应,双组分信号转导系统在其中具有重要作用。双组分信号转导系统通常由组氨酸激酶和反应调节蛋白组成,通过控制蛋白的磷酸化状态调节信号传导。近年来,有关牙龈卟啉单胞菌的双组分信号转导系统陆续被报道。本文就牙龈卟啉单胞菌的双组分系统的组成和功能进行综述。     

Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice

The suitability of a mouse model for host response in the induction of alveolar bone loss by Porphyromonas gingivalis was explored. The mouths of immunocompetent and severe combined immunodeficient (SCID) mice were infected with P. gingivalis ATCC 53977. P. gingivalis was not isolated from the mouths of these mice before infection, but was present at least 42 days after infection. P. gingivalis-specific IgG was present in sera from the infected, immunocompetent mice at the end of these experiments (42 days). Specific IgG was not present in sham-infected or uninfected immunocompetent mice, nor in any immunodeficient mice. Specific IgM was not present in any sera at 42 days. Infected, immunocompetent mice of two strains showed significant bone loss in comparison to sham-infected or uninfected immunocompetent mice (p < 0.05). Infected SCID mice, which are genetically lacking both B and T lymphocytes, also showed significant bone loss compared with sham-infected or uninfected SCID mice (p < 0.05). However, the degree of bone loss was greater in immunocompetent than immunodeficient mice: the relative amount of bone in infected mice was 77% of that in sham-infected immunocompetent mice, and 86% of sham values in SCID mice (p = 0.025). Thus oral infection of mice is a feasible model for studying the effects of host response on P. gingivalis-induced alveolar bone loss. Because bone loss was induced both in immunocompetent and SCID mice but was greater in immunocompetent mice, it appears that neither B nor T cells are absolutely necessary for bone resorption in response to P. gingivalis infection but they may significantly modulate the degree of resorption.     

谷氧还蛋白在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导脐静脉内皮细胞氧化应激中的作用

目的 从基因和蛋白水平研究谷氧还蛋白（Grx）在牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）诱导脐静脉内皮细胞（EA-hy926细胞）时的表达变化及其对Akt通路的调控作用。方法 采用牙龈卟啉单胞菌的LPS（1 000 ng·mL^-1）对EA-hy926细胞进行不同时间段（4、12、18、24 h）的刺激诱导,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测细胞grx1基因的表达变化;然后加入Grx特异性抑制剂氯化亚硝脲（BCNU）,使用Western blot法检测对照组、LPS组（1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）和BCNU组（25 μmol·mL^-1BCNU预处理30 min+1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）的Grx、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达情况。结果 LPS诱导下,EA-hy926细胞的grx1基因表达量在各个时间段均上调,12 h时grx1表达量最高。LPS诱导12 h时,LPS组的Grx蛋白表达量较对照组明显升高（P<0.05）,而BCNU可有效抑制Grx蛋白的表达（P<0.05）;Akt蛋白表达量在各组间无明显差异（P>0.05）,而LPS组的磷酸化Akt活性升高,显著高于对照组和BCNU组（P<0.05）,与Grx蛋白的表达趋势一致。结论 LPS可以从基因和蛋白水平诱导Grx的表达;Grx是Akt的潜在调节因子,可能对LPS刺激下Akt的调控具有重要意义。     

牙龈卟啉菌蛋白酶基因rgpA与rgpB蛋白酶区的克隆和表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)rgpA、rgpB蛋白酶区,构建rgpA、rgpB蛋白酶区原核表达系统。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从PgATCC33277菌株中扩增rgpA、rgpB蛋白酶区,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET42a的rgpA/rgpB蛋白酶区表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导其表达。结果所克隆的PgATCC33277菌株rgpA、rgpB基因蛋白酶区的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.0%,氨基酸序列同源性分别高达99.2%、99.1%。pET42a-rgpA/rgpB-E.coli BL21DE3系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的60%左右。结论本研究成功地构建PgrgpA、rgpB蛋白酶区高效表达系统,为测定RgpA、RgpB免疫原性及作用提供前提。     

Determination of active site of lysine-specific cysteine proteinase (Lys-gingipain) by use of a Porphyromonas gingivalis plasmid system

Porphyromonas gingivalis, a major etiological bacterium of periodontal diseases, produces a unique lysine-specific cysteine proteinase (Lys-gingipain, Kgp) implicated in the virulence of this organism. Our observations show the expression of a catalytically active recombinant Kgp in a P. gingivalis Kgp-null mutant and the restoration of its functions by the use of a shuttle plasmid vector stable in P. gingivalis. The Kgp-expressing mutant exhibited a similar catalytic activity to that of the wild-type strain. This mutant also restored the ability to form black-pigmented colonies on blood agar plates and to generate a 19-kDa haemoglobin receptor protein responsible for haemoglobin binding. In order to establish the importance of the active-site Cys residue and elucidate its role in bacterial black pigmentation we constructed three Kgp mutants with changed potential active-site Cys residues. The cells expressing a single mutation (C476A) showed the high Kgp activity and the black pigmentation. In contrast, the cells expressing the single mutant (C477A) and the double mutant (C476A/C477A) exhibited neither Kgp activity nor black pigmentation. These results indicate that the 477th Cys residue is essential for both the Kgp activity and the black pigmentation of P. gingivalis.     

Development and characterization of Porphyromonas gingivalis-specific rat T-cell clones.

Porphyromonas gingivalis has been implicated as a major pathogen in periodontitis. To determine the role of T cells in the regulation of this disease, a method was developed for the generation and characterization of rat T-cell clones with antigen specificity to P. gingivalis whole cells. The clones studied so far demonstrated a T-helper (Th) phenotype W3/13+, W3/25+, OX8− and OX22−. These T-cell clones proliferated in vitro in response to P. gingivalis, but not to other bacteria (Prevotella intermedia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Wolinella recta, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sanguis). Limiting dilution analysis showed W3/25+, OX8− T cells preferentially respond to P. gingivalis, rather than W3/25−, OX8+ T cells. P. gingivalis-reactive W3/25+ T cells belonged to the OX22− population, suggesting that the OX22− T cells may represent memory cells. All clones tested produced interferon γ, but not interleukin 2. The cloned T-cell F1 significantly enhanced P. gingivalis-specific antibody production (p < 0.03). The availability of these cloned T cells should bring new insight into the mechanism by which T cells regulate oral health and periodontal disease.     

慢性牙周炎唾液牙龈卟啉单胞菌的定量PCR检测

目的:定量检测慢性牙周炎患者、牙周健康人群唾液中牙龈卟啉单胞菌的含量,比较其在各组人群分布的差异。方法:应用SYBR Green模式的实时荧光定量PCR技术,针对Pg特异基因Arg-gingipain设计引物,检测20例慢性牙周炎和20例牙周健康者唾液内Pg的含量,t检验分析比较在各组人群中Pg定植的差异。结果:慢性牙周炎患者唾液中,Pg的检出数目为(1.78×10³~1.99×10⁵),检出率为85%;牙周健康者唾液中,Pg的检出数目为(2.19×10³~2.30×10³),检出率为10%。Pg在慢性牙周炎和牙周健康者唾液中检出数目和检出率的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:慢性牙周炎唾液中,牙龈卟啉单胞菌较正常人群明显升高,在今后的研究及防治中,不仅要观察龈沟液中的牙龈卟啉单胞菌,也应注意其在唾液中含量的变化。