多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

PCR检测速冻食品中金黄色葡萄球菌与沙门菌

目的探讨多重PCR法在速冻食品中金黄色葡萄球菌与沙门菌检测中的应用效果。方法应用金黄色葡萄球菌ATCC8095与沙门菌ATCC14028对速冻水饺进行人工染菌,分别取不同培养时间点增菌液采用水煮法、酚氯仿法与滤柱法剂盒法提取DNA,分析金黄色葡萄球菌与沙门菌多重PCR法在速冻食品中的检测灵敏度、检出时限及合适的DNA提取方法。结果通过不同持续培养时间检测金黄色葡萄球菌与沙门菌基因组DNA,在持续培养时间超过4 h时应用多重PCR法便可检测出速冻食品中100 CFU/g起始菌落数目的金黄色葡萄球菌与沙门菌。水煮法的产量最高、所需时间最短并且费用最低,而试剂盒法提取纯度最高。结论应用多重PCR法检测速冻食品中黄金色葡萄球菌与沙门菌的效果较好,具备良好的快捷性、高效性及稳定性。     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

基于多色量子点和免疫磁珠技术检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的建立基于量子点和免疫磁珠技术检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的方法。方法利用水相法合成多色的CdSe量子点,通过共价交联法将三色量子点与抗沙门菌、抗志贺菌和抗金黄色葡萄球菌的特异性抗体偶联,利用紫外吸收光谱和SDS-PAGE电泳证明偶联是否成功。利用免疫磁珠富集,量子点标记,通过荧光显微成像法对沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌进行检测。结果多色量子点与3种菌的特异性抗体偶联成功,通过选用3种不同颜色不同发射波长的量子点作标记,利用免疫磁珠富集3种菌,在同一反应体系中同时检测3种菌,检测时间在2h之内。对模拟感染目标菌的样品直接检测,检测限为103CFU/ml。结论该方法能够快速、特异性地检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

多重荧光PCR结合HANDS系统快速检测4种食源性致病菌

目的建立快速、准确检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的多重荧光PCR方法。方法将多重荧光PCR技术与HANDS系统结合,采用同源加尾的方式,构建四重荧光PCR体系,分析该体系的特异性,并进行模拟实验,该方法与国家标准检测方法进行方法比对实验。结果该系统检测出了4种目标致病菌。初始菌浓度分别为5、9、10、2、50、3cfu/ml的沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和兰氏A群、C群、G群链球菌增菌液,在增菌18h后都被体系检出。该方法与国家标准方法对样品的检测结果一致。结论首次结合HANDS系统构建了同时检测4种致病菌的多重荧光PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高,是检测沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的快速、准确方法。     

3种食源性致病菌共增菌及三重PCR检测

目的 建立沙门菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌三重PCR检测方法。方法 3株菌在本实验室自行研制的共增菌培养基(SSV培养基)混合培养16 h,分别对沙门菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、副溶血性弧菌collagenase基因设计特异性引物,建立三重PCR体系,通过对引物浓度、退火温度及循环次数进行优化,从而建立最优体系,并从特异性、重复性、灵敏性3个方面对体系进行评价。结果 三重PCR体系中,invA、nuc、collagenase引物浓度分别为10、12.5和12.5 nmol/L;最佳退火温度为55.6℃;目标菌的引物特异性好,且体系的检测灵敏度高,3株菌在三重PCR体系中的灵敏度都在10² CFU/mL以上。结论 建立的三重PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好。     

改良TT增菌液对沙门菌属和志贺菌属的分离效果研究

目的探讨改良硫代硫酸钠碳酸钙(TT)增菌液对肠道感染菌种沙门菌属和志贺菌属的分离效果。方法收集2015年3月-2016年9月288例因急性腹泻住院患者的粪便作为研究样本,对照组和观察组各144例,采用常规接种法接种于麦康凯琼脂培养基(MAC)和沙门氏菌-志贺氏菌琼脂培养基(SS),另外加种改良TT增菌液进行增菌培养,同时使用改良TT增菌液、革兰阴性(GN)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液分别对外购的沙门菌属和志贺菌属进行培养,比较不同增菌液对肠道感染菌种沙门菌属和志贺菌属的分离效果。结果对照组采用直接接种培养基的方法检测出沙门菌属15株,志贺菌属4株,检出率分别为10.42%和2.78%;观察组采用改良TT增菌液培养后接种方法检测出沙门菌属43株,志贺菌属12株,检出率分别为29.86%和8.33%;观察组沙门菌属与志贺菌属的检出率明显高于对照组(P<0.05);改良TT增菌液对沙门菌属的增菌效力与SC增菌液相当,其中对鼠伤寒沙门菌属增菌效果最高达到10-8,优于SC增菌液10-7,改良TT增菌液对志贺菌属的增菌效力与GN增菌液相似,两种志贺菌属的最大增菌效果均达到10-7。结论改良TT增菌液对沙门菌属和志贺菌属的增菌效果与SC、GN增菌液相当,不仅可以有效促进沙门菌属和志贺菌属的增殖,提高病原菌分离效果,还能简化工作流程,提高实验室工作效率。     

多重PCR检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157:H7方法的研究

[目的]建立12h内快速检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的多重PCR方法。[方法]探讨已报道的多重PCR体系检测粪便中3种目的菌的可行性,根据沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因及大肠杆菌O157︰H7rfbE基因筛选设计新引物,优化反应条件,测定方法灵敏度和特异性。8h短时增菌后,对24份模拟粪便样品进行检测。[结果]已报道的多重PCR体系不适用于粪便中3种目的菌的检测;新建立的体系适用于粪便样品的检测,能在12h内同时检测3种目的菌。通过短时增菌,该体系对粪便样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的灵敏度分别为:8.5cfu/10ml增菌液,27cfu/10ml增菌液,5cfu/10ml增菌液。对28株目的菌和13株非目的菌的检测结果表明该方法具有良好特异性。[结论]成功建立能在12h内同时检测粪便样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的多重PCR检测方法,该方法特别适用于健康带菌者3种目的菌的快速筛查,为卫生检验检疫、食品微生物安全的监测和监督提供一有用的工具。     

实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析

目的 了解双重实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌的效果.方法 采集从业人员肛拭子样本,用双重实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌,检出的疑似阳性样本按国标法进行培养鉴定.结果 采用双重实时荧光PCR反应体系共检测从业人员39 974人次,荧光PCR检测出沙门菌阳性41份,阳性率1.22‰,培养法检测出31份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.95％.荧光PCR检测出志贺菌10份,阳性率为0.25‰,培养法检测出3份,阳性率为0.08‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.98％.从样品处理到检测结果仅需要时间2h～ld.结论 双重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于从业人员体检的快速诊断和肠道传染病的初筛,为肠道传染病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

冰鲜肉鸡制品中食源性致病菌污染的调查

目的通过调查84份冰鲜鸡肉、鸡腿、鸡翅中的几种食源性致病菌,了解冰鲜肉鸡制品中食源性致病菌的污染情况,为控制污染提供科学依据。方法随机抽取市场上的84份冰鲜鸡肉、鸡腿、鸡翅,检测其中的沙门菌、志贺菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、致泻性大肠埃希菌等几种常见食源性致病菌。结果 84份样品中共检出沙门菌8株,检出率为9.52%、李斯特菌17株,检出率为20.24%、金黄色葡萄球菌45株,检出率为53.57%、O157H7型大肠埃希菌1株,检出率为1.19%。结论市售冰鲜肉鸡制品中食源性致病菌污染严重,特别是金黄色葡萄球菌污染率非常高,迫切需要加强对肉鸡的屠宰、加工、进出口等各环节进行检疫。     

市售鸡肉中金黄色葡萄球菌的分离及耐药性分析

目的调查市售鸡肉中金黄色葡萄球菌的污染情况和耐药情况,以了解食用鸡肉的安全性并为有效控制金黄色葡萄球菌危害提供依据。方法从雅安各大市场收集了197份新鲜鸡肉的胴体表面涂搽棉球,增菌培养后通过菌落形态、染色特性、生化试验,用药敏纸片法测定了8株金黄色葡萄球菌对17种抗生素的体外敏感性。结果从中共分离出8株金黄色葡萄球菌,分离率为4％。8株菌（100％）均对四环素、红霉寨、氟哌酸、复方新诺明、杆菌肽、链霉素、罗红霉素耐药;8株菌（100％）均对阿米卡星、先锋V、庆大霉素、多粘菌素卫、卡那霉素、利福平、氯霉素敏感;6株菌（75％）对新霉素敏感;2株菌（25％）对恩诺沙星敏感;7株菌（87．5％）对痢特灵敏感。结论鸡肉中金黄色葡萄球菌具有多重耐药性。     

食品中沙门菌检验方法的优化与应用

目的选择最适合食品中沙门菌生长的增菌培养基和分离培养基，促进沙门菌生长，提高沙门菌的检出率。方法在市场上购买一批生的禽、畜类肉制品，分别通过均质器混匀，各分成两份，分别用常规培养基和本实验培养基同时增菌培养，应用改良分子信标荧光PCR检测试剂盒和mini-VIDAS全自动荧光免疫分析仪对两种增菌液进行初筛，对结果阳性者划线分离，阳性菌株经VITEK2 COMPACT生化鉴定仪鉴定。结果样品经本实验增菌液增菌后，分离平板上的可疑菌落明显增多，检出沙门菌的几率也有很大提高。结论改用本实验培养基后，能有效提高沙门菌的检出率。     

Detection of salmonella in food products]

The Rappaport-Vassiliadis (RV) medium prepared under laboratory conditions from its different components was found to be equally suitable as the commercial RV Oxoid medium for routine detection of Salmonella in food products. The best detection (30 of 113 examined samples) was obtained using 0.1 ml of culture and 10 ml of medium. In case of 1 ml of culture and 10 ml of medium Salmonella was isolated only from 3 samples. Only 7 positive samples were obtained using MK medium. Necessity of preliminary toxicity verification for malachite green oxalate colour used in RV medium, to standard Salmonella strains, prior to routine food products tests, was found.     

吉林省2000-2009年食源性致病菌污染状况分析

目的了解吉林省食品中沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌的污染状况,确定可能污染上述致病菌的高危食品,为食源性疾病监测提供科学依据。方法依据国标方法,并采用显色培养基,对样品分别进行沙门菌、单增李斯特菌、EHEC O157:H7、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌分离、生化及血清学鉴定。结果检测生畜肉、生禽肉、熟肉制品、动物性水产品、生食蔬菜、乳及乳制品、速冻面米食品、非发酵豆制品等样品共4 238件,检出致病菌772株,总检出率18.22%。其中单增李斯特菌检出360株,检出率最高8.49%;其次为沙门菌检出328株,检出率7.74%;金黄色葡萄球菌检出30株,检出率2.88%;副溶血弧菌检出23株,检出率5%;EHEC O157:H7检出31株,检出率0.73%;未检出空肠弯曲菌。8类样品中致病菌阳性率最高的为生禽肉,占42.89%;其次为生畜肉,占40.95%;速冻面米食品,占22.22%;动物性水产品,占20.92%;生食蔬菜,占14.69%;非发酵豆制品,占11.83%;熟肉制品,占9.38%;乳及乳制品,占0.70%。结论吉林省居民主要消费食品存在食源性致病菌污染,其中生猪肉、生鸡肉、速冻面米食品是主要受污染的食品品种。     

宁波地区腹泻患者细菌性病原检测与分析

摘要：目的　了解宁波地区腹泻患者病原菌构成和耐药性,为防控感染性腹泻提供依据。方法　病原菌检
测采用直接分离与增菌分离相结合的方法;细菌筛检和鉴定采用生化和生化鉴定试剂条ＡＰＩ等法,鉴定到
种、群;病原菌血清分型采用血清凝集法;药敏试验采用Ｋ Ｂ法;耐药基因检测采用ＰＣＲ 法,统计学分析
采用ＳＰＳＳ１１．０软件包进行,率的比较采用χ
２ 检验和犉分析。结果　９２５６份标本中检出８类１６种３４７３
株病原菌,检出率为３７．５２％,其中,副溶血性弧菌、沙门菌和气单胞菌的检出率分别为１６．１３％ （１４９３／
９２５６）、３．９９％ （３６９／９２５６）和３．４４％ （３１８／９２５６）,副溶血性弧菌的检出率明显高于其他病原菌（χ
２＝
２１．６８,犘＜０．０１）;血清分型发现副溶血性弧菌的Ｏ３ 群（３４９／４８０）、沙门菌的甲型副伤寒菌（１６８／３６９）、
志贺菌的躈氏志贺菌（１１７／１７５）、致病性大肠埃希菌Ｏ１１９ （２８／６６） 为各病原菌的优势菌,检出了躈氏
１Ｃ、２Ｃ 和４Ｃ 志贺菌新亚型;药敏试验显示病原菌对大多数抗生素敏感,但有４５株为多重耐药菌,其中
气单胞菌２３株、志贺菌８株、致泻性大肠埃希菌８株、金黄色葡萄球菌３株、变形杆菌２株、沙门菌１株,
占总菌数的２．４５％,检出了犫犾犪 犜犈犕、狊狌犾犾和犪犪犮犮等３种耐药基因。结论　宁波地区感染性腹泻病原构成
复杂,副溶血性弧菌是最主要的流行病原菌;检出躈氏Ｃ 型志贺菌提示其血清型可能或正在转换,需加强
对志贺菌变迁的监测,以预防疾病的暴发;致病性不强的气单胞菌和类志贺邻单胞菌检出率较高,应引起
关注;耐药菌株中有２．４５％的病原菌为超广谱β 内酰胺酶（ＥＳＢＬ） 菌株,涉及多个菌属,提示临床治疗
中合理用药是减少耐药菌的传播和扩散的关键。
关键词：感染性腹泻;病原菌;分离鉴定;药敏
中图分类号：Ｒ５１２．５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０２ ００９６ ０６     

福建省首次检出14个沙门菌血清型

[目的]了解福建省沙门菌血清型分布情况,及时发现福建省尚未检出的沙门菌血清型。[方法]2003～2010年采集腹泻病人、服务行业人员粪便标本、1份鱼粉饲料和1份海鱼样品。应用沙门菌选择增菌液、培养基及显色培养基等分离,菌株并经"四管五项法"筛选,最后经系统生化及血清学试验确认。[结果]2003～2010年,福建省首次检出14个沙门菌血清型(变种),其中A～F群有8个型(变种),非A～F群有6个型(变种);肠道沙门菌亚种13个型、双相亚利桑那(Ⅲb)1个型,从人体中检出12个型,从鱼粉饲料及海鱼中各检出1个型。[结论]必需重视非A～F群及肠道亚种以外沙门菌的检验,以提高沙门菌的检测水平和监测水平。     

Evaluation of two enrichment broths, three plating media and ELISA technique for the isolation of salmonella from dairy products

Salmonella is one of the most important food-borne pathogens that can be transmitted through the consumption of contaminated milk and milk products. Early detection of Salmonella in food is important for food safety. Two selective media, brilliant green agar (BGA) and xylose lysine desoxycholate (XLD) agar are commonly used in diagnostic laboratories for the isolation of Salmonella, often after enrichment of the samples in a broth before plating on the solid medium. Recently, a new medium called CHROmagar Salmonella (CAS) has become available for the rapid detection of Salmonella. In the present study, we compared this new medium with BGA and XLD for the isolation of Salmonella from 160 dairy products samples (80 ice cream and 80 kariesh cheese samples) with enrichment in Rappaport- Vassiliadis (RV) and tetrathionate (TT) broth. TECRA Unique Salmonella ELISA test was used. Only one sample was positive for Salmonella, which appeared on each of CAS and XLD agars, after enrichment using RV but not TT. This was associated with a sensitivity and specificity of (100 %, 92.45%), (100%, 93.71%) and (0 %, 100%) for each of CHROmagar Salmonella, XLD and BGA respectively. TECRA Unique Salmonella test yielded the highest sensitivity and specificity among all used methods; it had 100% sensitivity with 100% specificity.