细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的：构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法：通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列.将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光.结果：成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论：该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系.     

pEGFP-N1-linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MH-CC97中的表达

目的:构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导人人肝癌细胞MHCCW中表达.方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体.利用电穿孔转染体外培养的MHCC97,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测lis基因转录水平的表达;Western Blot方法验证lis蛋白水平的表达.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,酶切和测序证明pEGFP-N1-lis真核表达载体构建成功.pEGFP-N1-lis转染MHCC97细胞后,Western Blot可以检测到lis蛋白在MHCC97细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-lis,可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.     

pEGFP-N1-Fcy::Fur重组质粒的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建携带融合型自杀基因Fcy::Fur的荧光真核表达质粒pEGFP-N1-Fcy::Fur,并观察其在卵巢癌细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,将pORF-Fcy::Fur中的Fcy::Fur目的基因亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-N1,以酶切1和测序鉴定重组质粒的正确性.应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入SKOV3细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)瞬时表达情况,用Western blot方法检测Fcy::Fur表达.结果:酶切和测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达.60%转染细胞发出绿色荧光.Western-blot检测到Fcy::Fur表达.结论:成功构建pEGFP-N1-Fcy::Fur荧光真核表达质粒,并可在卵巢癌细胞中有效表达,为卵巢癌基因治疗提供实验基础.     

小鼠FasL全长cDNA的克隆、真核表达载体构建及其在树突状细胞中的表达

目的 克隆小鼠FasL(mouse FasL,mFasL)全长cDNA,构建其真核表达载体,并验证其在小鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells,DC)中的表达.方法 采用RT-PCR和TA克隆技术,从激活的小鼠脾脏T淋巴细胞中扩增mFasL全长cDNA,亚克隆到T载体中,再克隆到pIRES2EGFP载体中.转染小鼠DC后,用RT-PCR、免疫荧光及Western blot检测mFasL mRNA和蛋白表达.结果 测序证实所得的mFasL cDNA序列与其在GenBank中的序列完全一致.mFasL真核表达载体转染小鼠DC后,能表达mFasL mRNA和蛋白.结论 成功克隆了mFasL基因,构建其真核表达载体,并证明能有效表达于DC中.     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因编码区全长序列，测序确认后，插入到pcDNA3．1真核表达载体中，双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞，检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3．1-mAFP真核表达载体，为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。     

人ST3Gal Ⅰ基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-N1-ST3Gal Ⅰ真核表达载体,分析其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的表达,筛选稳转细胞株,为进一步研究乳腺癌细胞膜连α2,3唾液酸与转移潜能调控提供细胞模型.方法 采用RT-PCR扩增ST3Gal Ⅰ全长基因片段,克隆至pEGFP-N1载体进行测序分析,用脂质体将重组真核表达载体pEGFP-N1-ST3Gal Ⅰ转染人乳腺癌细胞MCF-7中,经荧光显微镜观察及RT-PCR检测hST3Gal I的表达,G418抗性筛选稳转细胞株.结果 成功构建了真核表达载体pEGFP-N1- ST3Gal Ⅰ,体外转染MCF-7细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的hST3Gal Ⅰ,获得稳转细胞株.结论 成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的hST3Gal I真核表达载体,并在MCF-7中稳定表达, 为进一步研究乳腺癌细胞膜连α2,3唾液酸水平增高与其侵袭和转移潜能的调控提供实验基础.     

小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的 构建携带小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行研究其免疫学效应.方法 酶切含有小鼠全长IDOcDNA的PCOUS-2质粒,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度.RT-PCR和荧光显微镜鉴定和检测重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达,同时进行野生型腺病毒的检测.结果 经酶切及测序证实IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,且无野生型腺病毒的产生.结论 成功构建了含小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,为探讨IDO的生物学功能奠定了基础.     

大鼠Pdcd4基因真核载体的构建与表达

目的 构建大鼠程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4, Pdcd4)基因真核表达载体,为进一步研究该基因的功能提供条件。方法 提取E3大鼠肺组织总RNA,RT-PCR扩增大鼠Pdcd4基因全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pEGFP-C1-Pdcd4重组表达载体。将该载体转染大鼠巨噬细胞系NR8383细胞,通过RT-qPCR与Western blot法检测NR8383细胞Pdcd4基因的表达。结果 RT-PCR扩增的大鼠Pdcd4全长cDNA为1410bp;pEGFP-C1-Pdcd4重组真核表达载体中插入片段与NCBI GenBank文库中大鼠Pdcd4 cDNA的序列完全一致;倒置荧光显微镜下观察转染后NR8383细胞中绿色荧光蛋白的表达确定转染成功;RT-qPCR与Western blot法检测NR8383细胞中Pdcd4基因的表达水平明显上调。结论 成功构建pEGFP-C1-Pdcd4重组真核表达载体,为进一步研究Pdcd4基因的作用机制奠定基础。     

真核表达载体pEGFP-N2/AT2R的构建及其在原代血管平滑肌细胞的表达

目的体外构建携带血管紧张素Ⅱ2型受体(ANGⅡType 2 Receptor,AT2R)基因的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,并观察其在大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中的表达。方法以pUHD-10.3/AT2R质粒为模板,PCR扩增AT2R基因的全长cDNA序列,再将其克隆入载体pEGFP-N2,构建其真核表达载体pEGFP-N2/AT2R。以基因转染技术,将AT2R导入原代VSMCs。倒置荧光显微镜观测转染后VSMCs生长变化及AT2R在其中的表达等情况。图像分析技术检测AT2R在VSMCs中的转染效率。Western blot检测转染AT2R基因的VSMCs表达其编码蛋白。RT-PCR法对AT2R基因修饰的VSMCs进行鉴定。结果成功构建AT2R基因的真核表达载体pEGFP-N2/AT2R,该真核载体能携带AT2R基因转染并有效表达于VSMCs,其转染效率约40%,RT-PCR及Western blot均可检测到AT2RmRNA及蛋白在血管平滑肌细胞中高表达。结论成功地将克隆到的AT2R基因克隆入pEGFP-N2载体中,并实现了AT2R基因在原代VSMCs的表达。     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-ZNF217的构建及表达

目的克隆人类ZNF217基因cDNA全长,构建ZNF217的真核表达载体,并在真核细胞中表达。方法采用RT-PCR技术从人HO-8910卵巢癌细胞总RNA中扩增ZNF217 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pMD19-Teasy,测序证实碱基序列无误后,再克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果序列测定证实克隆的ZNF217全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实ZN217正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-ZNF217。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

人IL-37b基因真核表达载体的构建与表达

目的：构建pEGFP-N1/IL-37b真核表达载体,并检测其在THP-1细胞中的表达情况。方法：从人PBMCs中提取总RNA,利用RT-qPCR技术扩增出IL-37b基因编码区序列,克隆至pEGFP-N1真核表达载体,将构建的重组质粒pEGFP-N1/IL-37b转染到THP-1细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测IL-37的表达。结果：双酶切及基因测序结果显示 IL-37b基因正确插入真核表达载体pEGFP-N1中;RT-qPCR和Western blot结果显示转染THP-1细胞后,IL-37表达水平明显升高（P＜0.01）。结论：成功构建了新型抗炎因子IL-37真核表达载体pEGFP-N1/IL-37b,为进一步研究IL-37功能及与相关疾病的关系奠定基础。     

大鼠肝再生相关基因Tax1bp1与绿色荧光蛋白融合表达的研究

目的构建大鼠肝再生相关基因Tax1bp1的真核表达载体,融合绿色荧光蛋白并在再生肝中高效表达,观察目的蛋白的表达情况。方法利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术以大鼠再生肝为材料克隆Tax1bp1基因的开放阅读框(ORF),然后亚克隆到表达载体上构建重组表达载体pEGFP-N1-Tax1bp1,再用尾静脉液压法转入大鼠再生肝中进行绿色荧光蛋白融合表达。结果 Tax1bp1ORF克隆正确,融合绿色荧光蛋白重组表达载体pEGFP-N1-Tax1bp1构建成功;部分肝切除转基因6、12、24、48 h后均有荧光表达,Tax1bp1融合蛋白在上述时间点绿色荧光融合蛋白细胞转染率分别为8.7%、11.2%、14.5%和1.2%,转染率趋势同空载体绿色荧光蛋白表达情况一致。结论重组表达载体pEGFP-N1-Tax1bp1构建成功,并实现了绿色荧光融合蛋白的高效表达,为进一步研究肝再生相关Tax1bp1基因功能奠定了基础。     

应用绿色荧光研究人抑瘤素基因在CHO细胞中的表达

目的：建立一种简易、快速检测细胞内外源性基因稳定表达的方法。方法：以携带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1为骨架，将完整的 hOSM基因ORF克隆到pEGFP-N1上游的多克隆位点，构建表达载体pOSM-EGFP-N1，脂质体介导转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），G418筛选，挑选阳性克隆。荧光显微镜、流式细胞术分析转染了pOSM-EGFP-N1质粒的CHO细胞纯度。RT-PCR的方法分析OSM基因水平表达。结果：成功建立稳定表达OSM的CHO细胞株（CHO-OSM-EGFP），纯度达到99.76%，且OSM基因在CHO-OSM-EGFP细胞中稳定表达。结论：构建了携带绿色荧光、表达OSM的pOSM-EGFP-N1质粒转染的CHO细胞，只通过荧光显微镜观察和FCM检测细胞绿色荧光，即可明确OSM转染成功。为表达外源性基因阳性细胞的筛选提供了简易的方法。