磷脂酶C-γ1和γ2对成纤维细胞生长及增殖的影响

目的 观察磷脂酶C-γ1和γ2基因在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的成纤维细胞生长和增殖信号转导中的作用。方法 测定PDGF刺激后，敲除磷脂酶C-γ1基因的细胞株及其转染磷脂酶C-γ2基因后的生长和增殖能力，并对数据进行统计学分析。结果 磷脂酶C-γ1和γ2在PDGF引起的细胞生长、增殖信号转导中均有正调控作用，并不是必需的因素，两者有协同作用，但各自的作用力度和时期不同，γ1作用显著，γ2作用较弱且较晚；磷脂酶C-γ1对DNA合成和细胞周期进程有重要影响，缺失时，细胞G1和S期缩短，DNA合成能力增强；γ2对DNA合成无显著影响，但在野生型成纤维细胞中表达时，可使S期提前并相对延长。结论 在成纤维细胞中，磷脂酶C-γ1和γ2对细胞生长和增殖的影响各不相同，有相同处，起不同程度的协同作用；又有不同处，不能相互取代。     

PLC—γ1对血小板生长因子介导的细胞增殖的影响

目的观察磷酸脂酶C－γ1（PLC－γ1）对血小板生长因子（PDGF）介导的细胞增殖的影响。方法 应用无内源性PLC－γ1小鼠成纤维细胞株,观察在PDGF作用下细胞增殖情况（包括细胞内钙离子动员及DNA合成）,并与正常细胞株对照。结果 缺失PLC－γ1的细胞与正常细胞DNA合成显著增强,均出现细胞内钙动员;但PLC－γ1^-/-细胞DNA合成时间显著延长,钙流较PLC－γ1 / 值小且峰值出现较晚（P＜0．01）。结论 PLC－γ1在PDGF作用下成纤维细胞的增殖过程中有重要作用,当其缺乏时功能可被其他途径代偿。     

磷酸酯酶C—γ1对血小板生长因子介导的细胞迁移的影响

目的 生长因子诱导产生的细胞内信号分子参与调节细胞的增殖分化，磷酸脂酶C－γ1（PLC－γ1）被认为是连接生长因子和其下游信号传递分子之间的主要桥梁，但它在细胞分裂信号传递中是否必需。目前说法不一。本研究旨在阐明PLC－γ1在细胞分裂信号传导中的作用。方法 应用无内源性PLC－γ1小鼠成纤维细胞株，观察在血小板生长因子作用下细胞的迁移情况。结果 缺失PLC－γ1的细胞与正常细胞无显著差异。结论 当PLC－γ1缺乏时，在血小板生长因子作用下，成纤维细胞的迁移过程中其功能可被代偿。     

磷脂酶C—γ1在人胚组织中的表达

目的 研究磷脂酶C－γ1（PLC－γ1）在人胚组织中的表达情况。方法 收集人胚组织（包括软骨、软骨膜、骨骼肌）并行石蜡包埋及切片,采用免疫细胞化学ABC染色法观察人胚组织细胞中PLC－γ1的表达情况。结果 PLC－γ1在这几种细胞中均有较强的表达,主要位于胞质中。结论 PLC－γ1相关的细胞内信号传递途径对于人早期胚胎细胞的发育、增殖具有重要的生物学意义。     

γ-干扰素基因转染G422胶质母细胞瘤细胞的生物学特性

目的 研究重组腺病毒介导的小鼠γ -干扰素 (mIFN -γ)基因转染G422胶质母细胞瘤细胞的体外和体内生物学特性。方法 按重复感染度 (MOI)=1∶100转染G422细胞 (G422/mIFN -γ细胞 ) ,检测转染后不同时间mIFN -γ的表达 ;MTT法检测基因转染细胞的体外增殖活性 ,设立转染LacZ基因的病毒对照细胞和野生G422对照细胞。观察基因转染细胞接种于小鼠皮下后的成瘤性和小鼠存活期 ,LDH法检测荷瘤小鼠脾自然杀伤细胞 (NK)、细胞毒T淋巴细胞 (CTL)及腹腔巨噬细胞 (MΦ)杀伤活性。结果 mIFN -γ基因转染后2h即可在培养上清中检测到mIFN -γ表达。腺病毒mIFN -γ基因转染对体外G422细胞增殖能力无影响,而接种体内后肿瘤生长缓慢 ,小鼠存活期延长。G422/mIFN -γ细胞接种组小鼠脾NK、CTL及腹腔MΦ杀伤活性显著增强 (P<0.05)。结论 重组腺病毒可介导IFN -γ基因转染G422细胞并高效表达。IFN -γ基因转染的G422细胞具有瘤苗的作用 ,能诱导抗肿瘤免疫反应。     

大鼠γ-干扰素基因转染大鼠肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞的实验研究

目的：构建重组大鼠γ－干扰素真核表达载体，探讨其转染大鼠肺泡巨噬细胞（AM）和气道上皮细胞的可行性及表达水平。方法：采用RT－PCR技术克隆了大鼠γ－干扰素，并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN上，构成真核表达重组载体，将重组载体转染培养的AM和气道上皮细胞，用PCR法鉴定重组载体整合在细胞基因组DNA中，并检测细胞培养上清中γ－干扰素浓度和活性。结果：DNA测序证明，构建的重组载体中γ－干扰素的基因方向正确，DNA序列与Gene Bank中大鼠的γ－干扰素cDNA序列相同，转染后AM和气道上皮细胞基因组DNA的PCR产物电泳可见转染的重组载体DNA片段条带，pLXSN-IFN载体组的AM和气道上皮细胞培养上清中大鼠γ－干扰素学和活性显著高于pLXSN空载体组（P＜0．01）结论：本研究构建的大鼠γ－干扰素重组表达载体可成功地转染大鼠AM和气道上皮细胞，整合入基因组DNA，并分泌有活性的γ－干扰素，为进一步的体内基因转染研究奠定基础。     

蛋白激酶C介导磷脂酶C-γ1参与高温诱导热休克蛋白70表达

目的 研究蛋白激酶C(PKC)是否介导磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)参与高温诱导成纤维细胞热休克蛋白70(HSP70)表达的信号转导通路.方法 以基因敲除方法建立的缺失PLC-γ1基因(plcgl-/-)及野生型PLC-γ1基因(plcgl+/+)小鼠胚胎成纤维细胞为模型,Western免疫印迹-增强化学发光法检测高温诱导时PLC-γ1的磷酸化激活,PKC激酶检测试剂盒测定PKC激活程度,并以酶联免疫吸附(ELISA)法及MTT法测定PKC抑制剂白屈莱红碱(chelerthrine chloride,CH)和激活剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(phorbol12-myristate 13-acetate,PMA)对HSPT0表达及细胞热耐力的影响.结果 plcgl+/+细胞经高温处理,PIE-γ1出现磷酸化激活、PKC活性显著增强(P<0.01);plcgl-/-细胞PKC活性也有所增强,但明显低于plcgl+/+细胞(P<0.01).PKC抑制剂或激活剂能增强或降低两种细胞热耐力,对高温引起的两种细胞HSP70合成都有明显抑制或促进作用.结论 蛋白激酶C可介导磷脂酶C-γ1参与高温诱导成纤维细胞热休克蛋白70表达的信号传递.     

PPARγ2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带PPARγ2基因的腺病毒载体.方法 采用PCR技术从pcDNA3质粒中扩增小鼠PPARγ2基因,将PPARγ2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV.用脂质体(lipid body)转染法(infection protocol)将重组腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEas-1共转染293细胞,确定转染效率.结果 RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-PPARγ2PCR产物约为470bp;用抗PPARγ2单克隆抗体进行Western blot检测为阳性,感染的重组腺病毒载体在L02细胞中PPARγ2有较高的稳定表达.结论 成功构建携带小鼠PPARγ2基因的腺病毒载体.     

PPARγ2表达诱导NIH3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化

目的应用重组逆转录病毒载体介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活的受体γ2(mPPARγ2)基因在NIH3T3成纤维细胞中表达,并进一步研究其功能.方法从经荧光测序证实含正确mPPARγ2 cDNA序列的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2中,双酶切下mPPARγ2全长cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中,构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2.用PA317细胞对pGCEN/mPPARγ2及pGCEN进行包装,并用G418进行PA317细胞抗性克隆筛选,收集病毒上清,感染靶细胞NIH3T3成纤维细胞.表达mPPARγ2的NIH3T3成纤维细胞在含PPARγ激活物5,8,11,14-二十碳四烯酸(ETYA)等分化介质中培养,可被诱导向脂肪细胞分化.结果构建了含mPPARγ2全长cDNA重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2,获得了较高pGCEN/mPPARγ2及pGCEN的逆转录病毒上清.重组逆转录病毒载体可介导mPPARγ2在NIHT3T3成纤维细胞胞核中表达.油红O染色证实,表达mPPARγ2的NIHT3T3成纤维细胞在分化介质中培养分化10天后,胞浆中明显积聚了较多的中性脂肪,其细胞形态也与体内成熟脂肪细胞相似,而且这些细胞表达脂肪细胞特异性标志基因如AP2和leptin.结论本研究在体外成功地建立了由PPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化的模型,为进一步研究PPARγ2诱导脂肪细胞分化的分子机制奠定了基础.     

pTracer/mIFN-γ基因修饰对小鼠胚胎干细胞细胞生物学特性的影响

目的: 探讨IFN-γ基因转染对小鼠ES细胞生物特性的影响. 方法: 电穿孔法将pTracer/mIFN-γ共表达载体转入小鼠ES细胞,荧光倒置显微镜下观测绿色荧光,RT-PCR, ELISA检测转基因ES细胞IFN-γ表达. 碱性磷酸酶染色,测定ES/pTracer/mIFN-γ和ES细胞的细胞克隆形成率;无血清培养法诱导ES/pTracer/mIFN-γ细胞定向分化为神经前体细胞(NPCs),免疫组化法检测nestin表达. 结果: 转染共表达载体pTracer/mIFN-γ的ES/pTracer/mIFN-γ细胞发绿色荧光,有IFN-γ表达,转染72 h后的细胞培养液中IFN-γ量为(44.25±12.23) μg/L;ES细胞和ES/PTracer/mIFN-γ细胞的集落形成率分别为73.66%和70.89%,差异无显著性. ES/pTracer/mIFN-γ细胞经诱导可分化为nestin阳性NPCs. 结论: IFN-γ基因转染对ES细胞的未分化特性、增殖能力及向神经系统分化潜能无明显影响.     

人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制。方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1cDNA(3878bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1。通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Westernblotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经HindⅢ-NotⅠ酶切后,得到3878bp(PLCγ1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约1300bp及约8500bp两个片段,与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westernblot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础。     

稳定表达PLCγ1 siRNA慢病毒的构建及对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的 制备在人大肠癌系LoVo中稳定抑制磷脂酶C(PLC)γ1的重组慢病毒,建立PLCγ1表达降低的细胞系,以便客观研究该基因的作用.方法 制备产生PLCγ1 siRNA分子的重组慢病毒,在慢病毒感染LoVo细胞后以杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞系.应用Westem-blot和RT-PCR对细胞中PLCγ1的蛋白和mRNA表达水平进行分析.应用流式细胞仪分析PLCγ1 siRNA对细胞凋亡的影响.结果和结论 PLCγ1 siRNA显著下调了LoVo细胞中PLCγ1的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,显著增加了5-FU诱导的凋亡.     

胰岛素作用对胰岛β细胞磷脂酶Cγ1表达的影响

目的：观察胰岛素对大鼠胰岛β细胞内磷脂酶Cγ1（PLCγ1）表达的影响.方法：大鼠胰岛分离纯化.通过HE染色观察纯化胰岛的形态特征,采用免疫组织化学方法并结合激光扫描共聚焦显微镜和图像分析技术对胰岛β细胞表达不同时间（0,30,60,120,240min）内的PLCγ1进行半定量分析.结果：PLCγ1在胰腺的内外分泌部均有表达.与0min比较,胰岛素作用30,60min时胰岛β细胞表达的PLCγ1荧光强度有明显降低（P〈0.05）;而在240min时PLCγ1荧光强度与0min比较无明显差别.结论：胰岛素作用60min内可使PLCγ1表达下调;胰岛素-PLCγ1途径参与了胰岛素的信息传递.     

PLC-γ1对血小板生长因子介导的细胞增殖的影响

目的 观察磷酸脂酶C-γ1（PLC-γ1）对血小板生长因子(PDGF)介导的细胞增殖的影响。方法 应用无内源性PLC-γ1小鼠成纤维细胞株,观察在PDGF作用下细胞增殖情况（包括细胞内钙离子动员及DNA合成）,并与正常细胞株对照。结果 缺失PLC-γ1的细胞与正常细胞DNA合成显著增强,均出现细胞内钙动员;但PLC-γ1-/-细胞DNA合成时间显著延长,钙流较PLC-γ1+/+值小且峰值出现较晚(P<0.01)。结论 PLC-γ1在PDGF作用下成纤维细胞的增殖过程中有重要作用,当其缺乏时功能可被其他途径代偿。     

PPARγ2诱导脂肪细胞分化相关基因的克隆及鉴定

目的 分离和克隆小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2（mPPARγ2)诱导脂肪细胞分化的相关基因。方法 在体外建立mPPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞分化成脂肪细胞模型基础上,采用mRNA差异显示技术分离、克隆PPARγ2诱导的脂肪细胞高表达或低表达的cDNA片段,再通过半定量RT－PCR证实。结果 经mRNA差异显示技术分离到20条差异显示片段,进一步对差异显示片段进行PCR扩增,T／A亚克隆及测序分析,与Gen Bank基因数据库比较后,得到8个已知基因,一条新基因序列,2个EST序列和7个新的EST序列。半定量RT－PCR结果显示UNR基因在PPARγ2诱导的脂肪细胞中表达上调,而凋亡抑制因子5（AP15）的表达则下调。结论 UNR基因的高表达和API5基因的低表达可能与PPARγ2诱导脂肪细胞分化有关。     

磷脂酶Cγ2对自身反应性B细胞的调控作用

目的应用基因敲除小鼠模型研究磷脂酶Cγ2对无能B细胞产生的调节机制.方法采用流式细胞术分析野生型和PLCγ2缺失型小鼠无能B细胞的表型;同时用末端转移酶标记技术检测无能B细胞凋亡;溴脱氧尿嘧啶核苷掺入标记技术研究无能B细胞增殖情况.结果 PLCγ2缺失小鼠与PLCγ2野生小鼠相比,无能B细胞数量显著减少(P<0.01),无能B细胞凋亡率显著增加(P<0.01),而无能B细胞增殖率无明显差异(P>0.05).结论 PLCγ2信号提供了存活信号,PLCγ2参与了无能B细胞的调控过程.     

BPI23—Fcγ1重组蛋白核表达载体的构建、表达和生物学活性的测定

目的：构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化大肠杆菌ＤＨ５α,诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＢＰＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白;测定ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白的抗菌及免疫学活性。结果：⑴ＲＴ－ＰＣＲ获得预期的扩增产物－ＢＰＩ６００ｂｐ和Ｆｃγ１７００ｂｐ基因片段;⑵成功构建ｐＵＣ１８－ＢＰＩ１８０、ｐＵＣ１８－ＢＰＩ４２０和ｐＵＣ１８－Ｆｃγ１７００重组克隆载体,ＤＮＡ测序结果与文献报道一致;⑶成功构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,酶切图谱分析与预期结果相符;     

转染节律基因mPeriod2对小鼠正常细胞放射损伤的影响

目的评价mPeriod2（mPer2）基因转染后过表达对小鼠肺成纤维细胞NIH3T3放射损伤的影响。方法采用脂质体介导法将roPer2基因转染人NIH3T3细胞中，以空质粒pcDNA3.1和空白组为对照，采用流式细胞术检测mPer2基因在NIH3T3细胞中的表达，经过^60Co—γ射线放射处理后，用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布，采用平板克隆形成试验检测细胞增殖情况。结果射线照射后，与pcDNA3．1空质粒组和空白对照组相比，pcDNA3．1-mPer2转染组凋亡率下降，S期细胞所占比例增高，克隆形成率明显增高。结论节律基因mPer2过表达会使γ射线照射后的NIH3T3细胞凋亡下降，增殖加快，减弱了细胞的放射损伤。     

体内IFN—γ基因转染巨噬细胞对化疗小鼠免疫功能的影响

采用磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法，将ＩＦＮ－γ真核表达质粒直接注射至经大剂量化疗后的小鼠腹腔内，可成功地转染腹腔巨噬细胞（ＭΦ），并表达基因产物，能刺激脾脏增生，促进淋巴细胞增殖，增加腹腔巨噬细胞数量，提高腹腔ＭΦ的细胞毒活性，诱导腹腔ＭΦ产生ＩＬ－１，ＴＮＦ和ＮＯ。实验结果提示：ＩＦＮ－γ基因转染ＭΦ可增强化疗后受损机体的免疫功能。     

小鼠胚胎成纤维细胞介导的IL-12抗S-180肿瘤作用

目的：将IL-12重组载体转染入小鼠成纤维细胞,研究探讨转染后的抗肿瘤作用.方法：取小鼠胚胎获得原代成纤维细胞,应用PEI法将IL-12重组载体转染到小鼠胚胎成纤维细胞,同时设对照.建立肉瘤细胞（S-180）荷瘤小鼠模型,分别接种S-180细胞.于注射瘤细胞后定期给予转染后的成纤维细胞瘤体内注射,并设对照组.于致瘤后第21日处死小鼠,测肿瘤质量; ELISA法检测小鼠血清IL-12及γ-干扰素（IFN-γ）的表达; 检测NK（natural killer cells）细胞活性和脾淋巴细胞增殖情况、CD4/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的克隆能力.结果：抑瘤率、NK细胞活性及淋巴细胞增生反应、血清IL-12、IFN-γ水平、CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于对照组（P〈0.01）.结论：转染后的IL-12重组质粒可进一步增强机体的免疫功能发挥其抗肿瘤的治疗作用.