不同细胞生长因子组合对内皮祖细胞培养过程的影响

目的 观察不同细胞生长因子组合对体外培养过程中内皮祖细胞（EPC）数量和功能的影响。方法采用密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞，接种至包被有人纤维连接蛋白的培养皿，按照处理方式不同分为4组：对照组（不添加细胞因子）、VEGF组[加入血管内皮生长因子（VEGF）】、VEGF＋ECGS组[加入VEGF及内皮细胞生长添加剂（ECGS）]、多因子组（加入多种细胞生长因子），6d后倒置显微镜下观察各组细胞集落形成情况，测定黏附能力及收获的EPC数量。结果VEGF组及ECGS＋VEGF组细胞集落形成能力（11.53±1.72、1310±2．09）均显著强于对照组（587±0．55）（均P〈0.01】；ECGS＋VEGF组细胞黏附能力（55．53±18.32）显著强于VEGF组（24.92±4．31）（均P〈0．01）；多因子组细胞集落形成及粘附能力（33．83±5．10、65.22±10、98）均明显强于其余各组（P〈0．05或0．01）。VEGF组及VEGF＋ECGS组收获的EPC数量分别为对照组的185、284倍，均显著增加（均P〈0.01）；多因子组EPC数量虽多于VEGF＋ECGS组，但差异并无统计学意义（P〉0．05）。结论EPC体外培养时，添加VEGF及ECGS是一种经济有效的方法，可显著改善EPC的集落形成及黏附能力，增加EPC的收获数量。     

普伐他汀对内皮祖细胞培养中扩增及黏附能力的影响

目的:观察普伐他汀对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)培养中扩增及黏附能力的影响.方法:采用密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,接种到包被有人纤维连接蛋白的培养皿,分为对照组(未加细胞因子)、Ⅴ组(加VEGF10 ng/m1)、P0.1组(加普伐他汀0.1μmol/L)、P0.01组(加普伐他汀0.01 μmol/L),培养6 d后,采用流式细胞术PE-CD34及FITC-VE-Cadherin双标法测定各组扩增细胞数,采用黏附能力测定试验测定黏附能力.结果:Ⅴ组、P0.1组、P0.01组的扩增EPCs数显著高于对照组(P＜0.01),且P0.1组、P0.01组均显著高于Ⅴ组(P＜0.001).P0.1组、P0.01组的黏附EPCs数显著高于对照组(P＜0.001).结论:普伐他汀可显著提高培养EPCs的扩增能力及黏附能力.     

血管内皮生长因子基因修饰内皮祖细胞对内膜损伤血管修复的影响

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响,在体研究VEGF基因修饰EPCs对内膜损伤血管再内皮化的影响.方法 体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组.ELISA法检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响.基因修饰EPCs移植到内膜损伤血管模型中,观察基因修饰对EPCs修复内膜损伤的效应.结果 FITC-UEA-Ⅰ和DiⅠ-acLDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs迁移、黏附和增殖.基因修饰EPCs促进损伤内膜修复.结论 EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且促进EPCs的迁移、黏附和增殖,增强EPCs对损伤内膜修复的能力.     

兔外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的研究兔外周血内皮祖细胞(EPCs)的分离和定向培养的方法,并对其功能进行鉴定。方法从兔股静脉插管抽取静脉血20 mL,采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离单个核细胞,接种于人纤连蛋白包被的培养板上,分别予含血管内皮生长因子(VEGF)20 ng／mL或内皮细胞生长添加剂(ECGS)30μg／mL的M199培养基培养。培养2周后进行免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞。结果每毫升外周血可分离1×106～2×106个单个核细胞,两组均于接种后第2～3天细胞胞体增大,有的呈多边形或梭形;第4天出现条带或栅栏状分布;第7～8天梭形细胞增多;第14天左右出现细胞集落,其特点是中央为圆形细胞,外周是梭形细胞;添加VEGF的培养基组每接种5×105个单个核细胞出现5～10个细胞集落,而添加ECGS者出现8～15个。第4周,添加VEGF的培养基组的细胞开始脱落而死亡,而添加ECGS的细胞仍持续稳定生长,呈铺路石样分布。两组在荧光显微镜下均可见双阳性的EPCs,血管性假性血友病因子(vWF)染色阳性。结论采用VEGF和ECGS均可体外培养兔外周血内皮祖细胞,且均能使其诱导分化为内皮样细胞,而ECGS较VEGF诱导效果更佳。     

血管内皮生长因子对大鼠骨髓内皮祖细胞生物学特性的影响

目的 观察内皮祖细胞(EPC)在不同浓度血管内皮生长因子(VEGF)作用下的生物学特性,探讨VEGF对EPC生物学特性的影响.方法 采用密度梯度离心法获取鼠骨髓单个核细胞,培养7 d后收集贴壁细胞鉴定EPC,用含不同浓度VEGF(0、10、50 ng/ml)的培养基继续培养.采用MTT比色法、Transwell小室实验观察EPC的增殖和迁移能力,应用纤维蛋白凝胶观察EPC体外血管形成能力,流式细胞术检测EPC的分化能力.结果 培养7 d的细胞CD133和CD34阳性率分别为69.44%和81.05%.MTT实验显示,10 ng/ml组细胞的吸光值明显大于0 ng/ml组和50 ng/ml组,0 ng/ml组的吸光值明显大于50 ng/ml组(P＜0.05);迁移实验、体外血管形成实验及诱导分化实验显示,50 ng/ml组和10 ng/ml组较0 ng/ml组更能促进EPC的迁移、体外血管形成及诱导分化,且50 ng/ml组强于10 ng/ml组(P＜0.05).结论 VEGF能够提高EPC迁移能力、体外血管形成能力及促进诱导分化,且随着VEGF浓度的升高而增强.VEGF能够提高EPC增殖能力,但随着浓度的升高而减弱.     

序列黏附法从人外周血单个核细胞获得内皮祖细胞及鉴定

目的:探讨从成人外周血单个核细胞(PBMNC)中分离、培养内皮祖细胞(EPC)的方法以及EPC的生物学特征.方法:密度梯度离心法获得PBMNC,用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中.分别采用常规方法(A组)和序列黏附法(B组)培养.A组细胞于接种第4天洗去未黏附细胞,然后隔d换液1次;B组细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞,共2次.2组细胞均在第7天计数早期克隆,持续培养直到晚期克隆出现.流式细胞术检测2组早期克隆细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定B组早、晚期克隆细胞结合荆豆凝集素.结果:早期克隆数目的获得在2组间差异无统计学意义,但序列黏附法获得晚期克隆数目增加(P＜0.05),且B组的早期克隆细胞表达CD3减少(P＜0.05).晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d之间出现,其组成细胞与早期克隆相比,CD45、CD14表达减少,而CD146表达增加(P均＜0.05),只有晚期克隆再种植可形成第2代内皮细胞克隆.结论:晚期克隆细胞具有EPC的形态和生物学特征,应用序列黏附法可提高晚期克隆获得率.     

人VEGF 165基因转染大鼠内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组。ELISA检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响。结果FITC-UEA-Ⅰ和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且可促进EPCs的增殖,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

人VEGF166基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF166质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响。结果FITC标记剂豆凝集素I和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2FLk-1和VIII因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF166,VEGF165转染EPCs的转染率约22．5％;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础。     

人VEGF165基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的 探讨人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响.方法 体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF165质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响.结果 FITC标记荆豆凝集素Ⅰ和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2 FLk-1和Ⅷ因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF165,VEGF165转染EPCs的转染率约22.5%;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖.结论 hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础.     

肾毒血清对骨髓内皮祖细胞增生及血管内皮生长因子表达的影响

目的 研究肾毒血清对骨髓内皮祖细胞(EPCS)增生及血管内皮生长因子表达的影响.方法 分离SD大鼠骨髓内皮祖细胞,将其分为对照组和肾毒血清组[后者按所含肾毒血清的不同体积浓度(1.25%、2.5%、5.0%)分3个亚组,肾毒血清取自成模12周后的5/6肾切除模型大鼠];利用MTT检测EPCs的增生率,ELISA检测培养上清VEGF的浓度,RT-PCR检测VEGF mRNA的表达.结果 不同浓度的肾毒血清在不同时间点对培养EPCs均有不同程度的增生抑制作用(除1.25%的肾毒血清在12 h时外,其他均P＜0.01);同一浓度的肾毒血清对EPCs的增生抑制作用随着刺激时间的延长而增加,24 h的增生率显著低于12h(均P＜0.01),48 h的增生率显著低于24 h(均P＜0.01);12 h时,各肾毒血清组EPCs分泌的VEGF均显著高于对照组(均P＜0.01),24 h时,5.0%肾毒血清组EPCs分泌的VEGF则显著低于对照组(P＜0.01);48 h时,各肾毒血清组EPCs分泌的VEGF均低于对照组.对照组12 h、24 h和48 h时VEGF mRNA表达分别为(0.55±0.03)、(0.53±0.02)和(0.49±0.04),2.5%肾毒血清组12 h、24 h和48 h时VEGF mRNA表达分别为(0.50±0.02)、(0.34±0.02)和(0.15±0.01),2.5%肾毒血清组各时间点之间的VEGF差异有显著性(均P＜O.05).结论 肾毒血清能抑制EPCs的增生可能是通过抑制EPCs的VEGF mRNA表达、进而减少VEGF分泌而实现的.     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化。方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强。结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化.方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/ FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化.结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强.结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降.     

普伐他汀对培养人内皮祖细胞药理作用的影响

目的观察普伐他汀对培养人内皮祖细胞（EPC）数量、增殖、迁移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,贴壁筛选法培养内皮祖细胞,培养7d后收集细胞并分别加入普伐他汀10μmol／L及100μmol／L,干预48h,免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定内皮祖细胞,分别观察内皮祖细胞的数量、增殖迁移黏附能力、细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA的表达以及培养液中NO的水平。结果普伐他汀组促进外周血内皮祖细胞扩增,并显著改善外周血内皮祖细胞的黏附、迁移、增殖以及eNOSmRNA表达和NO合成的能力。结论他汀类药物可增加培养人内皮祖细胞数量并改善其功能。     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的 从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性.方法 采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定.结果 外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构.结论 该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志.     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性。方法采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构。结论该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志。     

5种造血生长因子对造血祖细胞集落形成的影响

目的 探讨IL－3、IL－6、GM－CSF、G2、PIXY321对骨髓造血祖细胞集落形成的影响。方法 5种造血生长因子分别采用100、250、500、750、1000u/ml浓度,进行骨髓造血祖细胞集落培养,从中找出峰值浓度,然后在峰值浓度下进行集落培养,计数不同造血生长因子条件下所形成的集落。结果 IL－3、IL－6、GM－CSF、G2、PIXY321对造血祖细胞集落形成的峰值浓度分别为100、100、250、750、250u/ml。峰值浓度下,对CFU－E、BFU－Em、BFU－Eim、CFU－GM形成的作用强度不同,PIXY321条件下所形成的集落数最多。结论 这五种造血生长因子对骨髓造血祖细胞的集落形成均有促进作用,PIXY321效果显著。     

EPCs移植对缺血再灌注肾损伤大鼠血管内皮生长因子的影响

目的:探讨EPCs移植对缺血再灌注肾损伤大鼠血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:雄性SD大鼠22头,随机分为3组:对照组、I/R组、EPCs组,术后1d处死各组大鼠,抽取外周血培养及鉴定内皮祖细胞,抽血检测大鼠的生化指标,采用RT-PCR技术测定三组大鼠VEGF mRNA的表达情况,行病理染色观察各组大鼠肾间质血管CD34的表达情况。结果:EPCs移植上调缺血再灌注大鼠VEGF mRNA的表达并改善了该组大鼠的肾功能,减轻了肾间质血管内皮细胞的损伤。结论:EPCs移植减轻大鼠缺血再灌注肾损伤可能与上调VEGF的表达有关。     

5种造血生长因子对造血祖细胞集落形成的影响

目的探讨IL-3、IL-6、GM-CSF、G2、PIXY321对骨髓造血祖细胞集落形成的影响.方法 5种造血生长因子分别采用100、250、500、750、10 00 u/ml浓度,进行骨髓造血祖细胞集落培养,从中找出峰值浓度,然后在峰值浓度下进行集落培养,计数不同造血生长因子条件下所形成的集落.结果 IL-3、IL-6、GM-CSF、G2、PIXY321对造血祖细胞集落形成的峰值浓度分别为100、100、250、750、25 0 u/ml.峰值浓度下,对CFU-E、BFU-Em、BFU-Eim、CFU-GM形成的作用强度不同,PIXY321 条件下所形成的集落数最多.结论这五种造血生长因子对骨髓造血祖细胞的集落形成均有促进作用,PIXY321效果显著.