氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中DNA损伤的研究

目的 探讨氯化镉恶性转化人支气管上皮(16HBE)细胞中DNA断裂损伤情况,进一步揭示氯化镉的致癌机制.方法 采用单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)检测氯化镉恶性转化人支气管上皮细胞中非转化16HBE细胞、氯化镉恶性转化第15代、第35代细胞及成瘤细胞的DNA链断裂情况.结果 与非转化16HBE对照细胞比较,氯化镉恶性转化16HBE第15代、第35代细胞和氯化镉诱发16HBE恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞的DNA损伤率分别达22.00%、46.75.00%和49.00%,明显高于非转化16HBE细胞的4.75%损伤率(P＜0.001),三种细胞彗星尾长也显著大于非转化16HBE细胞(P＜0.001).结论 细胞DNA损伤可能是镉化物分子致癌的重要机制.     

氯化镉诱发16HBE细胞恶性转化不同阶段P16基因甲基化研究

目的对氯化镉（CdCl2）诱发16HBE细胞系恶性转化不同阶段P16基因启动子区甲基化状况进行研究，探讨镉的表遗传致癌机制。方法从各组CdCl2恶性转化不同阶段及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞中提取全基因组DNA，采取甲基化特异性PCR法（Methylation—specific PCR，MSP）检测该基因组P16基因启动子区的甲基化状况，与非转化的16HBE对照细胞进行比较，并用去甲基化因子5-Azac（5-Aza-2＇deoxycytidine）处理有异常甲基化的细胞。结果CdCl2恶性转化及接种裸鼠成瘤的16HBE细胞P16抑癌基因启动子区CpG岛存在异常高甲基化现象，且随着细胞恶性程度的增加，甲基化现象有明显升高的趋势，同时发现有异常高甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化现象消失。结论P16基因启动子区的高甲基化导致抑癌基因表达关闭，无法正常发挥细胞增殖周期对细胞分裂和生长的负调控，造成细胞周期失控而导致无限制地细胞增殖，这可能是氯化镉诱导16HBE细胞恶性转化及接种裸鼠成瘤的一种表遗传致癌作用。研究结果可部分解释镉化合物的细胞转化作用及其可能的表遗传致癌机制，以及进一步对甲基化的表型逆转和药物治疗研究提供了重要依据。     

BPDE诱发16HBE恶性转化过程中eIF3 p36的表达变化

目的探讨二羟环氧苯并芘（BPDE）诱发人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化过程中不同阶段真核生物蛋白翻译启始因子（elF3 p36 mRNA）表达水平的变化，为进一步阐明BPDE的分子致癌机理提供线索。方法应用RT—PCR和FQ—PCR方法，检测并分析BPDE诱发16HBE恶性转化不同阶段的eIF3p36mRNA表达量的变化。结果相对于非转化对照细胞，BPDE诱发恶性转化16HBE不同阶段细胞（转化细胞和成瘤细胞）的eIF3p36mR-NA基因表达水平均显著高于对照组（P〈0．01或P〈0．05），其中BPDE-转化细胞的elF3 p36平均表达量分别是对照细胞的2．3～5．1倍：而BPDE-转化细胞与BPDE-成瘤细胞的elF3 p36平均表达量相比，差别无显著性（P〉0．05），提示elF3 p36的异常表达量与BPDE诱发16HBE细胞恶变程度之间存在一定的正向关系。结论BPDE在诱发16HBE细胞恶变过程中，存在明显的elF3 p36的异常表达现象，其表达水平与细胞的恶变程度密切相关，这可能是BPDE诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机理之一。     

钙激活Cl~-通道蛋白在急性呼吸窘迫综合征患者体外气道上皮细胞中的表达及其作用实验研究

目的:探讨钙激活Cl~-通道蛋白(CLCA)在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)体外气道上皮细胞中的蛋白表达情况,并初步探讨其作用。方法:运用脂多糖(LPS)刺激16HBE细胞系,Western Blot检测hCLCA1蛋白表达水平与ARDS的时程关系;运用hCLCA1-siRNA干扰16HBE细胞系中hCLCA1的表达,real-time RT-PCR法检测细胞系中hCLCA1的mRNA和蛋白表达水平,验证siRNA是否对目的基因成功抑制。同时检测炎症因子的mRNA表达变化水平,观察CLCA的降低与炎症因子表达的关系。结果:Western Blot结果显示:16HBE细胞系加LPS(1μg/ml)刺激12h、24h后hCLCA1的蛋白表达量下降,且LPS刺激24h后hCLCA1的降低有统计学差异(P<0.05)。real-time RT-PCR检测证实hCLCA1-siRNA对目的基因成功抑制,表明成功构建hCLCA1低表达的16HBE细胞系;同时real-time RT-PCR结果显示TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平升高(P<0.05)。结论:CLCA在LPS刺激后的培养HBE细胞系中蛋白表达水平下降,并表现为时间依赖性。抑制HBE细胞系hCLCA1的基因表达,则该细胞分泌炎症因子的水平升高,推测CLCA在ARDS体外气道上皮细胞分泌炎症介质过程中发挥负性调节作用。     

GPC5基因在肺腺癌细胞系中的功能研究

目的 研究GPC5基因在肺腺癌细胞系中的表达情况及其对肺腺癌细胞系生物学行为的影响.方法 采用逆转录PCR (RT-PCR)、实时定量PCR (qRT-PCR)以及Western blot分析肺腺癌细胞系中GPC5基因mRNA及蛋白表达情况;构建GPC5过表达载体及干扰载体,通过转染构建GPC5过表达细胞系及GPC5沉默细胞系;利用CCK-8法分析肺腺癌细胞系生长情况;通过流式细胞术检测肺腺癌细胞系的周期及凋亡变化.结果 检测了GPC5基因在4株肺腺癌细胞系(A549、H1299、H358和H1975)和1株肺正常上皮细胞系(HBE)中的mRNA表达情况,发现与HBE细胞系相比,GPC5基因在A549细胞系中呈低表达,在H1299细胞系中高表达,同时蛋白检测结果与mRNA水平一致;A549细胞中过表达GPC5基因可抑制细胞生长,引起细胞周期阻滞;在H1299细胞中干扰GPC5基因表达促进细胞生长,促进细胞周期;在过表达和干扰细胞模型中均未发现GPC5基因对细胞凋亡的显著影响.结论 GPC5基因可以对肺腺癌细胞系的生物学行为产生影响,可能是肺腺癌的抑癌基因.     

镉和镍恶性转化16HBE上调基因eIF3 p36的克隆与序列

目的分析镉和镍恶性转化16HBE（人支气管上皮细胞）成瘤细胞株中翻译起始因子eIF3 p36基因序列的变化情况，探讨镉、镍重金属的致癌分子机制。方法取正常对照16HBE细胞、氯化镉（CAC12）和结晶型硫化镍（NiS）恶性转化的16HBE细胞，用有限稀释法分别建立单细胞克隆株，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）获得目的基因翻译起始因子eIF3 p36的eDNA，将目的基因产物连接到T载体中，转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将三组DNA测序所得到的基因序列进行对比分析。结果镉、镍转化组各细胞株（各10株）翻译起始因子的eIF3 p36 cDNA测序结果与正常对照细胞（10株）比较未发现基因的突变位点；所有镉、镍转化细胞和正常对照细胞株eIF3 p36 cDNA序列与Genbank数据库进行同源性分析，相似性比值均为100％。结论实验中镉、镍恶性转化16HBE细胞中翻译起始因子eIF3 p36上调未见基因序列改变，提示在镉、镍致癌中可能涉及到表遗传机制。     

应用基因芯片技术筛查肺癌变相关基因的研究

目的 使用基因芯片技术研究肺鳞癌及化学致癌物诱导入气管上皮细胞恶性转化的癌变相关基因。方法 应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片分别检测6例肺鳞癌和6例正常肺组织的基因表达谱;并用上述芯片研究苯并(a)芘代谢产物BPDE[anti-Benzo(a)pyrene diolepoxide,BPDE]和结晶型硫化镍所诱导的人支气管上皮细胞恶性转化与正常的人支气管上皮细胞系(16HBE)在基因表达谱上的差异;将3类标本共同的差异表达基因确定为肺癌变的相关基因。结果 在肺鳞癌／正常肺组织之间、BPDE诱导的恶性转化细胞／正常16HBE细胞之间及硫化镍诱导的恶性转化细胞/正常16HBE细胞之间发现差异表达基因分别为171条、143条和151条。通过比较,发现89条与肺癌变相关的共同基因,其中表达显著增加的基因39条,它们是：癌基因6条;细胞周期相关基因4条;细胞增殖基因6条;肿瘤转移基因8条;神经内分泌基因3条;耐药基因1条;凋亡抑制基因1条;氧化基因1条;其他基因9条。表达显著下降的基因50条,它们是：抑癌基因7条;DNA修复基因11条;抗氧化基因1条;GST基因家族3条;细胞骨架基因3条;凋亡诱导基因2条;信号传导基因5条;细胞因子及其受体基因5条;细胞代谢基因7条,细胞外基质基因1条;其他基因5条。结论 cDNA基因芯片技术能有效地研究基因的表达谱,筛查出肺癌变相关基因。     

人气道上皮细胞内皮素转换酶-1反义RNA构建

目的　研究内皮素转换酶 -1(ECE -1)反义RNA对人气道上皮细胞ECE -1表达的抑制作用。方法　构建ECE -1反义RNA表达载体 ,用脂质体 (FuGENG 6)转染人气道上皮细胞株 (16HBE) ,G418筛选得到稳定表达反义ECE -1RNA的细胞株 (anti -16HBE)。RT -PCR检测转染细胞ECE -1mRNA的表达 ,Westernbloting检测细胞ECE蛋白表达情况。结果　①经酶切及DNA测序鉴定证明 ,0 7kb的ECE -1DNA片段反向连接到带有萤光蛋白基因为报告基因的pEGPC1表达载体 ;荧光倒置显微镜显示大量细胞分泌荧光蛋白并能反复传代稳定表达 ;②anti -16HBE细胞ECEmRNA基因表达 (ECE/actinβ 0 0 12 5± 0 0 5 8)比 16HBE细胞 (ECE/actinβ 0 13 4 7± 0 0 67)明显低 (P <0 0 5 ) ;而Westerbloting亦显示anti -16HBE细胞ECE表达量比 16HBE细胞明显低。结论　ECE反义RNA表达载体可抑制人气道上皮细胞ECE -1表达与分泌     

反义GFAP对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5增殖及分化的影响

目的观察抑制内源性胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)基因表达对恶性胶质瘤细胞生物学特性的影响,为进一步深入研究GFAP基因在胶质瘤恶性转化及诱导分化治疗中的作用提供实验基础.方法构建反义GFAP 逆转录病毒表达载体,经包装后以病毒上清感染人恶性胶质瘤细胞系CHG-5;采用RT-PCR、原位杂交以及免疫细胞化学方法检测GFAP基因及其蛋白的表达;并通过形态学、细胞生长曲线、软琼脂克隆形成及流式细胞分析等观察抑制GFAP基因表达后CHG-5细胞形态、增殖和细胞周期进程的变化.结果反义逆病毒感染后CHG-5细胞GFAP mRNA及其蛋白表达显著减弱甚至缺失,瘤细胞异型性增加,细胞增殖速度加快,体外成瘤能力增强,S期、G2/M期细胞比例升高.结论抑制内源性GFAP基因表达可使CHG-5细胞呈现更为恶性的表型,提示GFAP基因在调控胶质瘤细胞分化程度及恶性生物学行为方面具有重要作用.     

Malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor in bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride

Objective To analyze the relationship between malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor 3 （eIF3 p36） in human bronchial epithelial （16HBE） cells induced by cadmium chloride （CdCl2）. Methods 16HBE cells were treated several times with different concentrations of CdCl2. Tumorigenic potential of transformed cells was identified by assays for anchorage-independent growth in soft agar and for tumorigenicity in nude mice after the 35th passage. Total RNA was isolated from 16HBE cells induced by CdC12, including non-transformed, Cd-transformed, and Cd-tumorigenic cell lines. Special primers for eIF3 p36 were designed and the expression of eIF3 mRNA in different cell lines was detected with fluorescent quantitative-polymerase chain reaction technique （FQ-PCR）. Results The 35th passage of 16HBE cells transformed by CdCl2 exhibited overlapping growth. Compared with the non-transformed cells, colonies of transformed cell lines in soft agar showed statistically significant increases and dose-dependent effects （P〈0.01）. All Cd-induced transformed cell lines formed rumors in nude mice within 2 weeks of inoculation, but none of the mice injected with non-transformed cells showed tumors even after 3 weeks. All tumors were pathologically identified as poorly differentiated squamous cell carcinoma. The eIF3 p36 genes in different stages of 16HBE cells transformed by CdCl2 were elevated as compared with the non-transformed control （P〈0.01）, and the eIF3 expression increased with the degree of cell malignancy. Conclusion CdCl2 is capable of inducing morphological transformation in 16HBE cells and transformed cells are potentially tumorigenic. Over-expression of eIF3 p36 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl2 and may be one of the molecular mechanisms potentially responsible for carcinogenesis due to Cd.     

Alterative Expression and Sequence of Human Elongation Factor-15 during Malignant Transformation of Human Bronchial Epithelial Cells Induced by Cadmium Chloride

Objective To study the alternative expression and sequence of human elongation factor-1δ(human EF-1δ p31) during malignant transformation of human bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride (CdCI2) and its possible mechanism. Methods Total RNA was isolated at different stages of transformed human bronchial epithelial cells (16HBE) induced by CdCI<.2> at a concentration of 5.0 μM. Special primers and probe for human EF-1δ p31 were designed and expression of human EF-1δ mRNA from different cell lines was detected with fluorescent quantitative PCR technique. EF-1δ cDNA from different cell lines was purified and cloned into pMD 18-T vector followed by confirming and sequencing analysis. Results The expressions of human EF-1δ p31 at different stages of 16HBE cells transformed by CdCl<.2> was elevated (P<0.01 or P<0.05). Compared with their corresponding non-transformed cells, the overexpression level of EF-18 p31 was averagely increased 2.9 folds in Cd-pretransformed cells, 4.3 folds in Cd-transformed cells and 7.2 folds in Cd-tumorigenic cells. No change was found in the sequence of overexpressed EF-1δ p31 at different stages of 16HBE cells transformed by CdCl<.2>. Conclusion Overexpression of human EF-1δ p31 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl<.2>, but is not correlated with DNA mutations.     

16HBE细胞上皮间质转化模型建立以及麻黄-甘草药对对其影响

目的?体外诱导人支气管上皮细胞（16HBE）上皮间质转化（EMT）最适条件摸索以及探讨麻黄-甘草对EMT的影响。方法?以16HBE细胞株为研究对象,分别给予转化生长因子β1（TGF-β1）单一刺激以及血清饥饿联合刺激,运用Western blot法检测上皮及间质特征性蛋白的表达。运用免疫荧光检测E-Cadherin和N-Cadherin胞内表达分布情况。运用qPCR检测上皮及间质特征性基因的表达水平。血清饥饿联合TGF-β1刺激,给予麻黄-甘草药对干预,Western blot法检测上皮及间质特征性蛋白的表达水平。结果?TGF-β1可诱导16HBE细胞由结构规则、质密均匀的鹅卵石状向纺锤体状转化。TGF-β1单独刺激可诱导16HBE细胞N-Cadherin、α-SMA蛋白表达升高,对E-Cadherin、ZO-1蛋白表达未见明显影响。而当细胞密度为15%时,血清饥饿联合TGF-β1可诱导16HBE细胞N-Cadherin、α-SMA、Vimentin、Collagen Ⅰ蛋白、基因水平升高以及E-Cadherin、ZO-1蛋白、基因水平降低,并且E-Cadherin蛋白分布紊乱,上皮结构破坏。血清饥饿联合TGF-β1刺激,麻黄-甘草药对可抑制N-Cadherin、α-SMA的表达,并恢复E-Cadherin蛋白的表达,对ZO-1无明显影响。结论?血清饥饿联合TGF-β1能体外诱导16HBE细胞建立稳定可重复的EMT模型,可用于体外研究哮喘发生EMT相关机制。麻黄-甘草药对一定程度上可抑制16HBE细胞EMT过程。      

硒对镉转化人支气管上皮细胞系16HBE凋亡和癌基因表达的影响

目的研究在体外染毒条件下硒对镉转化人支气管上皮细胞系16HBE凋亡和癌基因表达的影响。方法用0.625、1.25、2.5和5.0μmol/L亚硒酸钠染毒镉转化16HBE细胞24h,用流式细胞术检测凋亡,用RT-PCR检测p53,bcl-2和bax表达。结果 0.625、1.25、2.5和5.0μmol/L亚硒酸钠染毒镉转化16HBE细胞后,随硒剂量升高细胞凋亡率增高,相关系数r=0.987 9(P<0.01),并且在1.25、2.5和5.0μmol/L亚硒酸钠剂量组的凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。亚硒酸钠可以抑制镉转化16HBE细胞p53和bcl-2的表达(P<0.05或P<0.01),bax表达虽有所增强但P>0.05。进行相关性分析,细胞凋亡与p53和bcl-2表达呈负相关,相关系数r分别为-0.923 6(P<0.01)和-0.862 1(P<0.05),而细胞凋亡与bax表达呈正相关,相关系数r=0.781 8(P<0.05)。p53表达和bcl-2表达呈正相关,相关系数r=0.894 1(P<0.05)。p53、bcl-2表达和bax表达之间呈显著负相关,相关系数分别为-0.822 2(P<0.05)和-0.961 3(P<0.01)。结论亚硒酸钠处理镉转化16HBE细胞,通过使p53和bcl-2表达下调、bax表达上调,诱导细胞凋亡从而起到抑制细胞恶性转化的作用。     

Inhibitory effects of selenium on telomerase activity and hTERT expression in cadmium-transformed 16HBE cells

Objective To investigate the effects of sodium selenite on telomerase activity and expression of hTERT mRNA in cadmium-transformed 16HBE cells.Methods Telomerase activity and expression of genes were measured after cultured cadmium-transformed 16HBE cells were exposed to sodium selenite at different doses(0.625,1.25,2.50,5.00 μmol/L)for 24 hours.Results Selenium decreased telomerase activity in cadmium-transformed 16HBE cells.There existed an obvious dose-effect relationship between the selenium concentration and these changes.The expression of hTERT and c-myc mRNA also decreased but the expression of mad1 mRNA increased after exposure to selenium for 24 hours.No difference was found in expression of hTRF1 and hTRF2 mRNA after incubated with sodium selenite for 24 hours,compared with control group.Conclusion Selenium inhibits telomerase activity by decreasing hTERT and c-myc mRNA expression and increasing mad1 mRNA expression in cadmium-transformed 16HBE cells and selenium concentration is significantly correlated with these changes.