靶向血管内皮生长因子的siRNA表达框架对喉癌细胞株Hep-2细胞生长的抑制作用

目的研究培养Hep-2细胞中，靶向血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的小干扰RNA表达框架（small interference RNA expression cassettes，SECs）对肿瘤细胞生长的影响，检测VEGF基因表达的情况，筛选最佳干扰序列，探讨RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则，设计出VEGF4个位点的干扰序列，然后进行合成，即为siRNA表达框架的下游引物。由于干扰试剂盒中采用RNA介导的u6聚合酶Ⅲ启动子和改良的终止序列，从而在靶细胞内可以高水平及精确地表达siRNA。我们将4个位点的PCR产物分别转染指数生长期的Hep-2细胞，48h开始观察和检测所产生的RNA干扰的效果。结果形态学检测：转染后的1366位点的细胞可见皱缩、变圆并开始脱落，而其他三个位点的细胞形态学上未见明显的改变；逆转录-聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，与对照组相比，1366位点细胞VEGF mRNA明显被抑制，吸光度为0．05，而其他三个位点的抑制效果不显著，吸光度分别是0．25、0．30和0．18。Western blot分析表明：与其他三个位点相比，1366位点的VEGF蛋白表达明显减弱；流式细胞仪检测表明：1366位点转染细胞的凋亡率为43％，而其他三个位点转染细胞的凋亡率改变不明显，分别为8．9％、6．5％和11．2％；本实验重复性强，同样的实验重复三次结果一致。结论研究表明靶向VEGF的1366位点的siRNA表达框架能高效抑制喉癌细胞株Hep-2细胞的生长。     

RNAi沉默PDCD4基因对人喉癌Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的 应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,探讨其对Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响。 方法 设计并合成针对PDCD4基因的shRNA质粒与阴性对照质粒,分别转染Hep-2细胞。实时定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后阴性对照组与干扰组PDCD4、β-catenin基因mRNA和蛋白的表达。克隆形成实验观察Hep-2细胞增殖能力的变化。 结果 与对照组相比,PDCD4干扰组的Hep-2细胞克隆形成率显著升高(P=0.01),PDCD4干扰组PDCD4mRNA和蛋白均显著减低(P<0.01)、β-catenin mRNA和蛋白均较对照组显著增加(P<0.01)。 结论 成功应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,Hep-2细胞克隆形成能力增强,β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高。     

血小板衍生生长因子-BB对喉癌Hep2细胞增殖侵袭的影响及其可能分子机制

目的 研究不同浓度血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)对喉癌Hep2细胞增殖侵袭的影响及黏着斑激酶（FAK）、磷酸化黏着斑激酶397（FAKpY397）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）蛋白表达的变化。方法 不同浓度(0ng／mL、1ng／mL、20ng／mL、100ng／mL)PDGF-BB诱导人喉癌Hep2细胞株,western blot方法检测FAK、FAKpY397、MMP2、MMP9表达变化,MTT法检测细胞增殖,侵袭实验检测诱导后细胞侵袭能力的变化。结果 MTT示诱导后Hep2细胞增殖,在20ng/mL浓度时达到最高,为（0.488±0.133）,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。侵袭细胞数在各组均有增加,在20ng/mL组达高峰为（22.75±1.42）,较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）,FAK、FAKpY397、MMP9、MMP2在20ng/mL浓度时表达上调。结论 PDGF-BB上调Hep2细胞中FAK、FAKpY397、MMP9及MMP2表达,促进Hep2细胞增殖侵袭能力增强。     

靶向转录因子NF-κB p65的siRNA对Hep-2细胞增殖及表达的影响

目的:以喉鳞状细胞癌Hep-2细胞为研究对象,应用RNAi技术特异性的抑制NF-κBp65的表达,观察其对癌细胞增殖、蛋白和mRNA表达的影响.方法:用NF-κBp65siRNA转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,采用Western Blotting方法检测Hep-2细胞转染前、后NF-κBp65的蛋白表达;采用RT-PCR检测Hep-2细胞转染前、后NF-κBp65的mRNA表达水平;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况.结果:Western Blotting结果显示随着NF-κBp65siRNA作用时间的延长,蛋白表达水平逐渐降低.半定量RT-PCR结果表明,转染NF-κBp65siRNA 24、48和72 h后的Hep-2细胞,与未转染组的Hep-2细胞相比,NF-κBp65 mRNA的表达水平逐渐下调(P＜0.05);MTT法显示不同时间NF-κBp65siRNA转染Hep-2细胞后,细胞增殖活性受抑制情况与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:NF-κBp65siRNA对Hep-2细胞的增殖活性有明显的抑制作用,并且可以特异性地抑制目的基因NF-κB p65在mRNA和蛋白水平上的表达,其作用具有时间依赖性.     

Re1A反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的:探讨Re1A反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法:设计Re1A反义寡核苷酸序列,转染Hep-2细胞后在不同的时间点行MTT检测瘤细胞生长抑制情况,取转染48 h的Hep-2细胞行克隆形成实验,应用RT-PCR和Western blot检测RelA mRNA和蛋白的表达.结果:MTT显示转染Re1A反义寡核苷酸可明显抑制Hep-2细胞的增殖,随时间延长抑制率升高,与对照组比较差异有统计学意义.克隆形成实验显示Re1A反义寡核苷酸的Hep-2细胞克隆形成率明显低于对照组,与对照组比较差异有统计学意义.RT-PCR和Western blot结果显示Re1A反义寡核苷酸分别在mRNA和蛋白水平显著抑制RelA基因表达.结论:Re1A反义寡核苷酸可抑制Re1A的mRNA和蛋白的表达,并抑制Hep-2细胞增殖和克隆形成.     

金丝桃素光照对喉癌细胞Hep-2的影响

目的 探讨金丝桃素对喉癌细胞Hep-2的影响。方法 体外培养的喉癌细胞Hep-2分别加入终质量浓度为0．5、1．0、2．0、3．0、5．0μg／ml的金丝桃素，加药后1h给予照射能量为7．5J／cm^2的光照10min，另取喉癌细胞Hep-2分别加入终质量浓度为5．0、10．0、20．0、25．0μg／ml的金丝桃素，不给予光照。各实验组均设空白对照组。继续培养48h后，应用荧光显微镜、四甲基偶氮唑盐[3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H tetrazolium bromide，MTT]法和流式细胞仪检测观察金丝桃素在光照和非光照条件下对喉癌细胞Hep-2的影响。结果 光镜下可见对照组喉癌细胞生长密集，细胞呈梭型或多角型，细胞彼此之间相接触。光照后小剂量金丝桃素组可见细胞数量明显减少，随着金丝桃素剂量的增加，细胞数量明显减少，在高剂量组可见细胞坏死。MTT结果显示光活化金丝桃素呈剂量依赖性抑制喉癌细胞的生长。流式细胞仪分析表明金丝桃素经光照后，可将喉癌细胞阻滞在G0-G1期，并诱导喉癌细胞凋亡；吖啶橙染色可见细胞胞膜出芽、染色质凝集、核片段化及凋亡小体等典型的细胞凋亡特征。金丝桃素单独应用，对喉癌细胞的抑制作用相对较弱。结论 金丝桃素经光照后，可有效抑制体外培养的喉癌细胞的增殖，并可诱导喉癌细胞凋亡。     

美洛昔康对人喉癌Hep-2细胞株作用的研究

目的探讨美洛昔康对喉癌细胞株Hep-2凋亡作用和对体外培养喉癌Hep-2细胞周期的影响及作用机制。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分实验组和空白对照组,培养不同时间后,用流式细胞仪检测美洛昔康对Hep-2细胞凋亡发生率及对细胞周期的影响,同时检测美洛昔康作用Hep-2细胞后细胞线粒体跨膜电位的变化。结果流式细胞仪分析显示美洛昔康呈浓度依赖性诱导Hep-2细胞凋亡,且实验组G1期细胞数明显增加,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;实验组Hep-2细胞线粒体跨膜电位明显下降,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论美洛昔康具有诱导Hep-2细胞凋亡及抑制细胞分化的作用,其机制可能与触发了线粒体凋亡途径有关。     

靶向c-myc基因的siRNA抑制喉癌细胞系Hep-2的研究

目的:探讨siRNA靶向人c-myc基因对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的抑制作用.方法:根据人c-myc基因设计和合成siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep-2细胞,进行MTT、形态学和实时PCR法检测,观察其干扰效果.结果:①MTT结果显示人端粒酶siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖;②实时PCR结果显示转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-myc mRNA表达明显减弱,转染组S3 c-myc mRNA 抑制率达到94%;③形态学结果显示人c-myc siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,肿瘤细胞异形性减小.结论:靶向c-myc的siRNA能显著抑制喉鳞状细胞癌生长增殖.     

c-myc siRNA联合氟尿嘧啶抑制人喉癌Hep-2细胞增殖的体内外研究

目的 观察c-myc小干扰RNA(siRNA)联合氟尿嘧啶(5-Fu)抑制喉癌Hep-2细胞生长的体内外作用,探讨在喉癌治疗中将c-myc作为基因治疗靶点的价值.方法 利用RNA干扰技术将c-myc siRNA转染到喉癌Hep-2细胞中,Western blot法检测c-myc蛋白的表达,流式细胞仪检测c-myc siRNA与5-Fu单独或联合应用,对喉癌细胞周期的影响.构建裸鼠移植瘤模型,观察c-myc siRNA及联合5-Fu对肿瘤生长的影响.免疫组织化学法检测c-myc在肿瘤组织中的表达;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)检测肿瘤组织细胞的凋亡情况.结果 在转染c-myc siRNA后的喉痛Hep-2细胞中,c-myc 蛋白的表达水平逐渐下调;G0-G1期的细胞开始增加,同时S期的细胞逐渐减少;当转染c-myc siRNA 细胞联合使用5-Fu时,G0-G1期的细胞明显增加,为(79.3.±2.1)%,同时S期的细胞减少为(17.5±1.7)%.c-myc siRNA联合5-Fu组移植瘤生长最慢,与c-myc siRNA组和5-Fu组相比差异有统计学意义(t值分别为44.170和78.988,P＜0.05);c-myc siRNA+5-Fu组治疗的移植瘤重量明显小于对照组,也小于c-myc siRNA组和5-Fu组(P值均＜0.05).免疫组织化学结果显示,c-myc siRNA及其联合5-Fu组肿瘤组织中c-myc蛋白的表达下调,肿瘤细胞的凋亡数明显增加高于单用5-Fu组(t=-17.871,P＜0.05).结论 c-myc siRNA可特异性地下调Hep-2细胞和裸鼠组织中c-myc的表达,联合5-Fu时,可显著抑制喉癌移植瘤的生长,促进肿瘤细胞的凋亡,表明c-myc可能是喉癌基因治疗中一个重要的分子靶点.

Abstract：

Objective To observe the effects of small interfere RNA (siRNA) targeting the c-myc in combination with 5-fluorouracil (5-Fu) on the growth of Hep-2 cells in vitro and in vivo.Methods Hep-2 cells transfected with or without c-myc siRNA were treated with 5-Fu for 48 h.C-myc protein levels in Hep-2 cells were detected using the Western blot.The cell cycle was analyzed by flow cytometry.Hep-2 cells were subcutaneously inoculated into the back of BALB/c nude mice to establish the implanted laryngeal squamous carcinoma model.PBS,c-myc siRNA,and 5-Fu,alone or in combinations were administered i.p.The mice were sacrificed after the treatments and the tumor masses were removed to determine the tumor volume and weight.The inhibitory rate was calculated.Expression of c-myc in tumor tissue was detected by immunocytochemistry and cell apoptosis was analyzed by terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL).Results The protein levels of c-myc decreased after transfected with c-myc siRNA.C-myc siRNA-transfected cells showed an increase in the percentage of cells in the G0-G1 phase and a decrease in the percentage of cells in the S phase.When combined with 5-Fu,the results were improved.The tumor growth was faster in the control group and was significantly slower in the c-myc siRNA plus 5-Fu group than that in the c-myc siRNA group or 5-Fu group ( P ＜0.05 ) .The tumor weight in the c-myc siRNA plus 5-Fu group was significantly smaller than that in the c-myc siRNA or 5-Fu group ( P ＜ 0.05 ).Immunohistochemistry showed that c-myc siRNA inhibited the expression of c-myc in tumor tissues in the c-myc siRNA group and c-myc siRNA plus 5-Fu group (P ＜0.05).The number of apoptotic cells in the c-myc siRNA plus 5-Fu group was higher than those in the c-myc siRNA groups (P ＜0.05).Conclusions C-myc siRNA inhibits the expression of c-myc in Hep-2 cells and in the tumor tissues of nude mice.C-myc siRNA combined with 5-Fu inhibits the growth of implanted laryngeal squamous carcinoma and promotes cell apoptosis.C-myc could become a novel target for the treatment of laryngeal squamous carcinoma.     

槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用

目的:探讨槲皮素对体外培养的人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2生长的影响及作用机制,研究槲皮素治疗喉癌的可行性.方法:采用MTT法、倒置相差显微镜及流式细胞仪观察槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用情况.结果:槲皮素呈时间和浓度依赖性抑制Hep-2细胞的增殖,使Hep-2细胞贴壁能力减弱,形态变小变圆,悬浮细胞和颗粒增加,引起Hep-2凋亡,细胞周期阻滞于S期.结论:槲皮索能够抑制喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的生长和增殖,其抑制作用与细胞凋亡有关.     

塞来昔布诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2特异抑制剂--塞来昔布对喉癌Hep-2细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及可能机制。方法 以不同浓度的塞来昔布处理喉癌Hep-2细胞,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响, Hoechst33342染色荧光显微镜下观察细胞核的形态改变,以Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率,Western blot检测Bcl-2、Bax及COX-2的表达, Western blot分析Caspase-3裂解激活。结果 MTT结果表明塞来昔布抑制Hep-2细胞的增殖呈时间和浓度依赖;Hoechst33342 荧光染色见随塞来昔布处理时间延长,细胞核逐渐出现凝集、碎裂等凋亡表现;流式细胞术检测细胞凋亡率见塞来昔布处理细胞24h, 70、100μmol/L组凋亡率分别为(28.9±2.74)%、(32.7±3.96)%;Western blot分析蛋白表达,见随药物处理浓度增加,COX-2、Bcl-2表达降低,Bax表达增加,随药物处理时间延长Caspase-3出现裂解片段。结论 塞来昔布能够有效地抑制Hep-2细胞增殖和诱导Hep-2细胞凋亡,其诱导凋亡作用机制可能与Bax／Bcl-2比值升高,Caspase-3蛋白裂解激活有关。     

靶向封闭survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的体外实验

目的：探讨靶向抑制survivin表达对喉癌细胞凋亡和增殖的影响。方法：构建survivin反义RNA表达载体。用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2,利用G418（300g／L的维持浓度）筛选,获得稳定转染株（HpEGFP／survivin）。用Western-blot检测survivin反义RNA封闭survivin后蛋白表达效果。吖啶橙染色和流式细胞仪、四唑盐（MTT）和软琼脂集落形成实验分别检测HpEGFP／surivin的凋亡和增殖状态的改变,并与Hep-2和转染空载体的细胞（HpEGFP-C1）进行比较。结果：Western-blot结果表明,构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制了Hep-2 survivin蛋白的表达。转染反义survivin RNA载体的HpEGFP／survivin较Hep-2和HpEGFP-CI凋亡增多,其凋亡率较空载体对照组增加1．81倍,而其增殖力下降（P〈0．01）,软琼脂集落形成能力也明显下降（Pd0．05）。结论：构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制survivin蛋白的表达,并拮抗了survivin基因的抗凋亡作用,抑制喉癌细胞体外增殖能力和生存能力。     

Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

白藜芦醇抑制喉癌Hep-2细胞系的生长

目的:研究白藜芦醇对喉癌细胞系Hep-2细胞生长的抑制作用。方法:在显微镜下计算细胞密度,MTT法绘制细胞生长曲线并计算细胞生长抑制率,利用软琼脂集落形成实验在倒置纤维镜下观察白藜芦醇处理Hep-2细胞前后细胞形态学变化及计算集落形成率。结果:各浓度的白藜芦醇均可使细胞生长曲线降低,细胞倍增时间延长。白藜芦醇也可以明显抑制Hep-2细胞形成集落,并发现白藜芦醇对细胞形态的影响与药物的剂量有明显的关系。结论:白藜芦醇对喉癌细胞系Hep-2细胞生长的抑制具有时间和剂量依赖性。     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.     

Skp2 siRNA表达载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因表达的抑制作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对Skp2的siRNA表达载体,抑制喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因的表达。方法:根据设计siRNA的原则,针对人Skp2的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到真核表达载体pGPU6/Neo中构建重组体pGPU6Skp2,转化DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后,进行序列测定。然后转染重组质粒至Hep2细胞中,应用流式细胞术检测Skp2基因的表达。结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列。pGPU6Skp2转染细胞后,Skp2基因在蛋白水平的表达量受到明显抑制。结论:成功构建了针对人Skp2的siRNA表达载体,通过转染Hep2细胞,可有效抑制细胞Skp2的表达,为后续基因治疗研究奠定了实验基础。     

巨噬细胞集落刺激因子对喉鳞状细胞癌喉癌细胞株的作用

目的:了解和探讨巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)及其受体对喉鳞状细胞癌细胞株(Hep2)细胞系的作用。方法:使用氚标记胸腺嘧啶核苷(3HTDR)掺入法和MTT法测试MCSF作用于Hep2后细胞的增殖状况,并测试加入巨噬细胞集落刺激因子受体(MC-SFR)抗体后细胞生长情况。ELISA法测试M-CSF作用Hep2细胞后上清中的MCSF的浓度变化。结果:Hep2细胞培养后较培养前的上清中的MCSF的浓度升高。加入的M-CSF浓度越大,细胞增殖越差,加入MCSFR抗体浓度越大细胞增殖越好。结论:MCSF对喉癌细胞Hep2细胞的增殖具有抑制作用。