普伐他汀对人I型胶原α1(I)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人I型胶原α1(I)链启动子活性的调控 ,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响。方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养。构建含人α1(I)前胶原基因5'侧翼序列 -2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)的重组体 phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞 ,CAT -ELISA测定普伐他汀对重组体的作用。结果设对照组的CAT值为1 ,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04 ,普伐他汀能明显抑制I型胶原α1(I)启动子的活性。结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(I)前胶原基因表达。     

普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性调控的研究

目的：研究普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ期胶原合成的影响。方法：大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代,传代培养,构建含人α1（Ⅰ）前原基因5'侧翼序列－2．5kb与报告基因氯霉素乙酰基转酶（CAT）的重组体phCOL2.5,用FuENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT－ELISA测定普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1（Ⅰ）启动子和活性。结论：普伐他汀可以在转不水平上调节α1（Ⅰ）前胶原基因表达。     

人α2(Ⅰ)型胶原基因启动子活性研究

目的探索器官纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF-BB、IGF-1等细胞因子对其活性的影响. 方法从人α2(Ⅰ)胶原基因转录起始点上游-2.4kb至+58bp的片段中,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞,测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性,同时加入细胞因子,以测定其对Ⅰ型胶原启动序列的影响. 结果除 -129～+58bp序列外,其余4个重组体CAT表达水平均较高,其中-2292～+58bp、-1476～+58bp序列具较强启动CAT表达活性,-339～+58bp、-616～+58bp片段次之.TGF-β、IGF-1均能在一定程度上调人α2(Ⅰ)胶原基因启动活性. 结论人α2(Ⅰ)胶原基因片段-2292～+58bp、-1476～ +58bp、-339～+58bp有高启动活性,是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列.TGF-β、IGF-1促进胶原表达,与其上调胶原基因启动活性有关.     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响1

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原(COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响.方法构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～+42bp(0.27kb)与-2483～+42bp(2.5kb)片段.将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性.结果13nmol/LIGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍.2.5μmol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍.TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性.结论IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-α、IFNγ、IFNα能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用.     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

细胞因子对小鼠α2（Ⅰ）型前胶原基因启动子活性影响的研究

目的;探讨细胞因子对小鼠α２（Ⅰ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α２（Ⅰ）型前胶原基因启动子（－２ｋｂ～＋５４ｂｐ）为靶序列,将它与氯霉素乙酰基转移（ＣＡＴ）报告基因组成的重组体ｐＡＺ１００９用脂质体法转染至胶原产生细胞ＮＩＨ／３Ｔ３细胞,讨论ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＦＮα对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强抑制作用,     

人α2（I）型胶原基因启动子活性研究

目的 探索器官纤维化形成中调控I型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF－BB、IGF－1等细胞因子对其活性的影响。方法 从人α2（I）胶原基因转录起始点上游－2.4kb至＋58bp的片段中，取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的质粒组成5个重组体，转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞，测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性，同时加入细胞因子，以测定其对I型胶原启动序列的影响。结果 除－129～＋58bp序列外，其余4个重组体CAT表达水平均较高，其中－2292～＋58bp、－1476～ 58bp序列具较强启动CAT表达活性，－339～ 58bp、－616～ 58bp片段次之。TGF－β、IGF－1均能在一定程度上调人α2（I）胶原基因启动活性。结论 人α2（I）胶原基因片段－2292～ 58bp、－1476～ 58bp、－339～ 58bp有高启动活性，是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。TGF－β、IGF－1促进胶原表达，与其上调胶原基因启动活性有关。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人a1（I）前胶原启动子活性的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子1（IGF-1）和胰岛素对人a1(I)前胶原（COL1A1）基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子a(TNFa）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素a(INFa）对这一作用的影响。方法：构建含 COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～ 42bp(0.27kb)与-2483～ 42bp(2.5kb)片段。将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFa或IFNγ或IFNa,测定CAT活性。结果：13nmol/L IGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍。2.5umol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍。TNFa、IFNγ、IFNa能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性。结论：IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-a、INFγ、IFNa能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用。     

内皮素-1诱导培养的人肺动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA表达

为研究内皮素-1(ET-1)对培养的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响,应用贴块法培养人胎儿肺动脉平滑肌细胞,应用免疫细胞化学染色、原位杂交方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA的表达.结果显示,加入含10-8mol/L ET-1的培养液培养48h和72h后,HPASMC Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白表达明显增强.提示ET-1能够诱导培养的人肺动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加,其调控机制之一是在转录水平上增强了Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达.     

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响①

目的研究TGF-β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因上游启动子活性的影响。方法以含小鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游0.4、0.8、2.0 kb启动片段为研究靶序列，以氯霉素乙酰基转移酶（CAT)作报告基因，应用基因转染技术研究小鼠胶原启动子活性。结果TGF-β可促进小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因启动序列的启动活性，而中药抗纤复方可明显抑制其启动活性。结论TGF-β和中药抗纤复方都可作用于胶原α2(Ⅰ)基因调控片段，进而促进或抑制胶原合成。     

人B细胞活化因子基因启动子活性研究

为探索与自身免疫病发病密切相关的B细胞活化因子(BAFF)基因高水平转录的启动序列及IFN-γ等炎性细胞因子对其活性的影响,以人BAFF基因转录起始点上游-1 349 bp至-329 bp的片段为靶序列,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,脂质体转染法转染上述重组体至人骨髓白血病细胞株:HL-60,CAT-ELISA测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性;同时加入细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、重组人BAFF蛋白(rBAFF),以测定其对BAFF启动序列的影响。结果表明,-1 349~-329 bp、-1 349~-743 bp序列具有强启动调控活性,而-1 349~-1 099 bp片段启动活性最低。细胞因子IFN-γ、IL-10和rBAFF均能在一定程度上调人BAFF基因的启动活性,IL-4则一定程度地抑制BAFF基因的启动活性。研究提示,人BAFF基因-1349~-743 bp片段是进一步研究BAFF基因转录相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在转录水平影响BAFF合成和分泌。     

不饱和脂肪酸影响HepG-2细胞PAI-1表达的机制初探

目的：探讨不饱和脂肪酸对HepG-2细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响及其机制。方法： 以发色底物法检测PAI-1活性，RT-PCR法检测PAI-1 mRNA水平；构建两个含不同片段缺失的PAI-1启动子序列控制表达的氯霉素转移乙酰酶（CAT）报告基因质粒，转染HepG-2细胞，ELISA法检测CAT表达量。结果： 油酸、亚油酸诱导下HepG-2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著高于对照组；共转染过氧化体增殖物激活型受体表达质粒（PPARα-pSG5）PAI-1转录活性显著增加；转染NF-κB样蛋白结合序列缺失的重组质粒，亚油酸诱导下PAI-1转录活性显著增加，而转染VLDL/脂肪酸反应元件缺失的重组质粒则无显著变化。结论： 不饱和脂肪酸增强HepG-2细胞PAI-1 mRNA表达及活性；PPARα可能是其上调PAI-1表达所涉及的转录因子之一，且VLDL/脂肪酸反应元件在该调控中具有重要作用，但可能并不涉及NF-κB信号转导途径。     

多种细胞因子对转化生长因子β1转录的调控作用

目的探讨细胞因子TNF-α、IFN-γ、IFN-α、PDGF-BB、bFGF对TGF-β1启动活性的影响.方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得含有人TGF-β1基因启动子序列的-1 328～+812 bp片段,与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因构建重组体phTGF2.14, 将其瞬时转染大鼠nFSC细胞,加入细胞因子进行干预,测定CAT活性.结果10 ng/ml TNF-α可以使重组体的CAT活性升高3.24倍;浓度为1 000 U/ml的IFN-γ、IFN-α使phTGF2.14的CAT活性分别降低至对照的(42±12)%、(58±6)%;浓度为10 ng/ml的PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的活性没有影响;IFN-γ、IFN-α和TNF-α联合应用TGF-β1基因启动子的活性分别为对照的1.32和1.46倍.结论TNF-α可促进TGF-β1基因启动子的活性;IFN-γ、IFN-α则对TGF-β1基因启动子的启动活性有抑制作用;IFN-γ、IFN-α可以阻断TNF-α对TGF-β1基因启动子的促进作用;PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的启动活性无影响,此研究为进一步研究细胞因子在纤维化疾病的相互作用机制提供了依据.     

应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素调控人α1(Ⅰ)型胶原基因转录

目的应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素对人COL1A1基因转录的调控。方法建立稳定转染pCOLH12.5质粒(含CAT基因与人COL1A1基因-2483～ 42bp片段)的WI-38细胞株,加入不同剂量胰岛素,测CAT值;分别瞬时转染不同序列ssPT入克隆细胞株中,加入2.5μmol/ml的胰岛素,测CAT值。结果2.5μmol/ml的胰岛素显著增加了COL1A1基因启动子活性;含sp1位点的ssPT浓度为120 nmol/L时,受胰岛素刺激所增加的CAT值得到显著抑制,不含sp1位点的ssPT无此作用。结论ssPT能够应用于基因转录调控的研究。胰岛素在人COL1A1基因上的反应元件可能位于启动子-129至-105区域内。     

Ⅰ型胶原基因转录调控的研究进展

调控Ⅰ型胶原(COL1)基因转录的顺式作用元件位于启动子和第一个内含子中。顺式作用元件及其结合的转录因子有生物种类特异性。一些转录因子以不同的亲和力与其部分潜在结合位点结合,它们间的相互作用稳定了DNA的环状结构,并引发转录。转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子在转录水平参与COL1基因的调控,在COL1基因启动子上有它们的反应元件。     

IL-1β增强主动脉平滑肌细胞内Ⅰ型IP3受体表达

目的：探讨白细胞介素1(IL-1)对主动脉平滑肌细胞株(A7r5细胞)Ⅰ型珉受体蛋白过度表达的影响。方法：通过对主动脉平滑肌细胞培养，应用蛋白杂交技术、核酸杂交技术分别检测在IL-1β作用后，主动脉平滑肌细胞中Ⅰ型三磷酸肌醇(IP3)受体蛋白和Ⅰ型IP3受体mRNA的表达及Ⅰ型IP3受体mRNA半衰期的测定，同时研究IL-1β对Ⅰ型IP3受体基因启动子的作用。结果：IL-1β能增强主动脉平滑肌细胞内的Ⅰ型IP3受体蛋白的表达，两者呈剂量依赖关系；IL-1β也能使Ⅰ型IP3受体mRNA水平增高；通过对Ⅰ型IP3受体mRNA半衰期的测定明确IL-1β对Ⅰ型IP3受体mRNA影响不是抑制mRNA的降解，而是诱导其表达增加。IL-1β作用4小时时，装有Ⅰ型玛受体启动子的质粒上的报告基因表达增加，而8小时时，报告基因的表达即降至IL-1β作用前的水平。结论：IL-1可能作用于Ⅰ型IP3受体mRNA的基因启动子，使Ⅰ型IP3受体mRNA合成增加，导致Ⅰ型IP3受体蛋白表达增加，由此构成了主动脉平滑肌细胞内储备Ca^2 释放，引起动脉平滑肌细胞收缩、舒张功能异常的病理生理基础。     

细胞因子对小鼠α2(I)型前胶原基因启动子活性影响的研究

目的：探讨细胞因子对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因启动子（－２ｋｂ～＋５４ｂｐ）为靶序列,将它与氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因组成的重组体ｐＡＺ１００９用脂质体法转染至胶原产生细胞ＮＩＨ／３Ｔ３细胞,讨论ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：ＴＮＦα抑制小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因启动子活性,ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强这种抑制作用。结论：ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强抑制作用,这可能与ＩＦＮγ、ＩＦＮα诱导ＴＮＦα受体表达,从而加强ＴＮＦα抑制作用有关,而ＩＦＮγ抑制胶原蛋白合成作用与该序列无直接相关。     

pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景：Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。 目的：构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。 方法：设计和合成包含5’非转录区的约2 000 bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coli DH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组：对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1 promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。 结果与结论：重组质粒DNA测序结果采用NCBI blast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强 (P < 0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

PIP反义核酸对乙肝病毒PRE转录后调节的影响

目的 研究乙肝病毒转录后调节元件(PRE)结合蛋白PIP在PRE转录后调节机制中的作用。方法 用质粒pcDNA3．1(-)构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP；用pAS-PIP转染HepG2细胞，再将依赖于PRE转录后调节的CAT报告质粒转染上述细胞，通过ELISA方法检测CAT的表达水平。结果 成功构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP；基因转染结果显示，与转染空载体组相比，转染pAS-PIP反义核酸组CAT水平下降21．97％。结论 PIP反义核酸可有效地降低依赖于PRE的CAT的表达,PIP在PRE转录后调节中起着重要的作用。     

过氧化体增殖物激活型受体对血管内皮细胞PAI-1转录的调节

目的:探讨血管内皮细胞中过氧化体增殖物激活型受体(PPARs)的表达及其对纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)转录的调节作用。方法:培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增PPARα、δ和γ;以PAI-1启动子控制表达氯霉素转移乙酰酶(CAT)报告基因的重组质粒PAI-pCAT转染人血管内皮细胞株ECV304、并同时分别共转染250、500、1000ng的PPARα或PPARγ表达载体,酶联免疫吸附方法(ELISA)测定CAT表达量-启动子片段转录活性。结果:HUVECs中可检测到PPARα、δ和γ的mRNA水平表达,并且表达量PPARγ明显小于PPARα(P＜0.01)和PPARδ(P＜0.01);增加PPARα表达可剂量依赖地提高ECV304细胞PAI-1转录,而增加PPARγ表达对ECV304细胞PAI-1的转录无影响。结论:血管内皮细胞存在3种PPARs的表达,其中PPARα涉及对PAI-1基因转录的诱导调节。