重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN(1～4)的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN(tudor staphylococcal nuelease)蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与(;"蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN(1～4)重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN(1-4)质粒成功构建和表达.     

连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及相互关系研究

目的观察连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及探讨两者之间的相互关系。方法RT-PCR获得Cx36全长编码区基因片段,与PCR2．1TOPO克隆载体连接测序,亚克隆到pcDNA3真核表达载体,脂质体介导法转染HeLa细胞,G418抗性筛选阳性克隆,Western blotting,双标记免疫荧光和免疫沉淀分析HeLa细胞Cx36和ZO-1表达及关系。结果构建了重组真核表达载体Cx36-pcDNA3,转染的HeLa细胞获得稳定表达Cx36的克隆,Western blotting显示转染的HeLa细胞表达Cx36蛋白。双标记免疫荧光染色显示,HeLa细胞膜之间Cx36呈点状或线状表达,在Cx36表达部位也同样表达ZO-1。免疫沉淀显示细胞裂解液分别与抗ZO-1或抗Cx36抗体共沉淀,抗Cx36或抗ZO-1抗体进行免疫检测,前者在36kD有特异性Cx36蛋白带,后者在220kD处有ZO-1蛋白带。结论转染Cx36的HeLa细胞表达Cx36和ZO-1,两者共表达并且相互结合。     

NY-ESO-1/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白NY-ESO-1/GST进行纯化和初步鉴定。方法:设计针对NY-ESO-1的特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的cDNA文库扩增NY-ESO-1基因片段,经上下游引物所引入的EcoR I和Xho I双酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游,构建重组表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST融合蛋白,经不同浓度尿素洗脱纯化后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量(Mr)为44 000,与理论值相符,并主要以包涵体形式存在,灰度扫描分析显示融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的90%,Western blot结果证实该NY-ESO-1/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,提示为融合蛋白。结论:成功构建了NY-ESO-1基因原核表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的包涵体形式NY-ESO-1/GST融合蛋白。     

VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的: 构建人血管内皮细胞生长因子II型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白.方法: 由公司合成VEGFR2胞膜外区第三、第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列, 克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游, 构建重组表达载体pGEX4T-VEGFR2D3.4, 将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS, IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白, 经不同浓度尿素洗脱纯化后, 表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果: SDS-PAGE分析表明, 表达产物的相对分子质量(Mr)为46 000, 与理论值相符, 主要以包含体形式存在; 灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6%, 纯化产物纯度最高为87.1%, Western blot 证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.结论: 利用大肠杆菌表达系统, 获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白.     

A组链球菌M蛋白重组多肽原核表达载体构建及融合蛋白的表达

目的:设计针对A组β溶血性链球菌M1和M12蛋白的复合多肽;构建含M蛋白基因(emm基因)1型和12型特异性抗原决定簇基因及其保守区J14肽基因的GST标签的重组表达载体;并诱导和优化GST融合蛋白的表达.方法:在NCBI Genebank和Olig0 6引物设计软件中选择分别编码M蛋白emm基因1型和12型信号肽后35个氨基酸及其相同的保守区14肽基因序列(全长270 bp),通过重叠PCR(Overlap PCR)合成所需的核苷酸序列,经测序确定序列完全和设计的相匹配后,将该重组片段克隆到pGEX-4T-1表达载体中,阳性克隆经双酶切和测序鉴定正确后建立稳定表达该重组质粒的大肠杆菌BL21株系(pE/B);通过聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色和Western blot来检测在不同时间(O、2、6、8、18和24小时)和温度(25℃、30℃和37℃)以及不同浓度(0.01、0.1、1 mmol/L)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导GST融合蛋白(GST/emm)表达情况,并对诱导表达的GST/emm切胶进行质谱分析鉴定.结果:成功构建含有emml和emm12抗原决定簇及M蛋白保守区J14肽基因的原核表达载体;并诱导其稳定表达,在1 mol/L IPTG诱导6～8小时达高峰,不同温度下均有过量表达;质谱检测诱导蛋白GST/emm条带结果正确.结论:成功构建A组p溶血性链球菌的emm1型和emm12型原核表达载体,并稳定诱导GST/emm表达,为下一步研究GST/emm的纯化、酶切以及免疫原性的鉴定和疫苗研制打下夯实的基础.     

PLC-β3与syntrophin蛋白的相互作用

 目的 探索并鉴定PLC-β3与PDZ蛋白syntrophin的相互作用,为进一步研究PLC-β3在神经系统信号转导通路中所扮演的角色提供线索。方法 制备GST-PLC-β3-CT融合蛋白,利用GST pull down的方法,检测PLC-β3-CT与β2-syntrophin和γ2-syntrophin的PDZ结构域的相互作用。结果 构建重组质粒pGEX-PLC-β3-CT,在大肠杆菌BL21中成功表达融合蛋白后,利用GST pull down的方法证实了PLC-β3-CT可以与β2-syntrophin而不是γ2-syntrophin的PDZ结构域相互作用。结论 PLC-β3与β2-syntrophin的相互作用的研究结果,为研究完整的PLC-β3与β2-syntrophin的相互作用以及这种相互作用在神经系统信号网络中的功能提供了线索。     

GST-snail融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的制备snail多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法PCR扩增编码人snail 264个氨基酸的cDNA全长片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β—D-硫代半糖苷（IPTG）诱导表达GST／Snail融合蛋白。经电泳纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、免疫荧光和免疫印迹法鉴定血清特异性和效价。结果成功构建了pGEX-4T-1／snail原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白GST—snail,免疫产生的snail多抗可特异检测snail真核表达载体转染COS-7细胞后snail的表达及定位情况。结论获得了效价和特异性都良好的snail抗体,适合对snail的检测应用。     

人GST-PTEN融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化。方法将全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-PTEN,转化BL-21感受态细胞。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达PTEN融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析证实蛋白表达的特异性。并用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-PTEN,并将PTEN融合蛋白的成功表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析,证实了蛋白表达的特异性。并对蛋白进行了纯化,获得了GST-PTEN融合蛋白的纯品。结论成功表达、纯化了GST-PTEN融合蛋白,为进一步研究PTEN蛋白的功能及其与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

SETD4蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统的表达

目的　通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4（SET domain-containing 4）蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。 方法　提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至pFastBac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。 结果　经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 kD处可检测到目的条带。 结论　成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。     

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白3C表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化柯萨奇病毒(CVB5)非结构蛋白3C,免疫雄性大鼠制备多克隆抗体.方法 通过酶切质粒获取3C基因序列,构建到原核表达系统大肠埃希菌中诱导表达重组的3C蛋白,使用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,重组的3C蛋白作为抗原,免疫雄性SPF级大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价并Western印迹检测抗体特异性,用该抗体检测病毒在细胞内的复制.结果 构建了重组表达载体命名为3C-pET-28a,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达重组3C蛋白.ELISA测定制备的多抗血清效价为1:500 000,Western印迹检测在EV71、CVA16中都有交叉反应,并确定病毒感染细胞后24 h开始复制.结论 实验成功地利用原核表达系统表达柯萨奇病毒非结构蛋白3C,为进一步研究柯萨奇病毒的感染机理以及疫苗制备提供了基础.     

蛋白质与蛋白质相互作用的研究进展

通过研究蛋白质与蛋白质的相互作用,人们能更好地注释蛋白质的功能,解码生命现象,特别是在新药物的设计上具有极大的实用价值,这是后基因组研究的重要任务之一。蛋白质结构的剖析、计算机分子模拟技术的发展和分子生物学技术更新为研究蛋白质间相互作用创造了各种有利条件。     

Global analysis of protein function using protein microarrays

Protein microarrays containing thousands of proteins arrayed at high density can be prepared and probed for a wide variety of activities, thereby allowing the large scale analysis of many proteins simultaneously. In addition to identifying the activities of many previously uncharacterized proteins, protein microarrays can reveal new activities of well-characterized proteins, thus providing new insights about the functions of these proteins. Below, we describe the construction and use of protein microarrays and their applications using yeast as a model system.     

腺苷酸活化蛋白激酶与骨骼肌蛋白质降解*☆

背景：机体运动时骨骼肌收缩,ATP被大量消耗,产生大量腺苷一磷酸,导致腺苷酸活化蛋白激酶的激活。 目的：综述不同运动过程中腺苷酸活化蛋白激酶活性的变化,以及腺苷酸活化蛋白激酶对骨骼肌蛋白质降解的研究成果。 方法：检索中国期刊网、维普期刊数据库、www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed和http://highwire.stanford.edu/网站与腺苷酸活化蛋白激酶、运动、蛋白质降解研究相关的文章。并对腺苷酸活化蛋白激酶的结构与作用,不同运动过程中腺苷酸活化蛋白激酶活性的变化,以及腺苷酸活化蛋白激酶升高对骨骼肌蛋白质降解的内容进行分析综述。 结果与结论：共纳入相关文献35篇。本文综述了腺苷酸活化蛋白激酶的结构、作用的研究进展;在抗阻运动和中到大强度的周期运动中,腺苷酸活化蛋白激酶活性都可能升高,而在小强度周期运动过程中腺苷酸活化蛋白激酶活性可能不升高;腺苷酸活化蛋白激酶的活化可能对骨骼肌蛋白质的降解有促进作用。     

TSHR蛋白表达质粒的构建和TSHR蛋白的表达

目的：为获得足量的ＴＳＨＲ蛋白及建立Ｇｒａｖｅｓ’病的动物模型。方法：将构建于ｐＣＲ＾ＴＭ３中的ＴＳＨＲ ｃＤＮＡ经限制性内切酶处理后,重新构建于表达型载体ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘ质粒中,经酶切分析和ＰＣＲ检测,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ免疫印迹法检测其免疫活性．结果：证明ＴＳＨＲ ｃＤＡ基因正确地重组于ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘ中,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达     

C-reactive protein

Over the past few years substantial insight was gained into the biol ogy and biochemistry of human C-reactive protein (CRP). X-ray crystallography in conjunction with mutational analyses, generated the three-dimensional structure of the protein and indicated the topology and structure of ligand-binding sites. Using human CRP transgenic mice infected withStreptococcus pneumoniae, we obtained data that clearly established CRP as an important host defense molecule. Studies using the same mice revealed a previ ously unknown testosterone-dependence of constitutive expression of human CRP. In this article we provide a brief overview of these recent findings.     

Tamm-Horsfall protein

Human Tamm-Horsfall glycoprotein, the major urinary protein, is a glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) - anchored membrane protein which mainly resides at the luminal face of cells of the thick ascending limb of Henle's loop (TAL) and early distal convoluted tubules of nephron. Tamm-Horsfall protein contains exclusively N-linked glycans, mainly of polyantennary type largely sialylated and fucosylated, but also high-mannose glycans. Only a portion of the Tamm-Horsfall protein is released as soluble protein by the action of proteases and in a minor amount by a cell-associated GPI-specific phospholipase. The physiological function of Tamm-Horsfall glycoprotein has not been clarified to date. Since the urinary Tamm-Horsfall protein has a high gel-forming tendency, it has been postulated that it takes part in the water impermeability of TAL. It is also proposed that the Tamm-Horsfall protein plays a protective role towards pyelonephritogenic pathogens such as Escherichia coli. The Tamm-Horsfall protein may inhibit the colonization of these pathogens in the renal mucosa in that the soluble form competes with that exposed at the plasma membrane. Recently, urinary Tamm-Horsfall protein has been implicated in tubulointerstitial nephritis.     

Phosphorylation of hepatitis C virus core protein by protein kinase A and protein kinase C

Hepatitis C virus (HCV) core protein can form capsid-like particles and is believed to be the viral capsid protein. Besides its structural functions, this protein is also known to possess multiple regulatory functions. In this article, we have studied the possible phosphorylation of HCV core protein in two different human liver-derived cell lines Huh7 and HepG2. Our results indicated that the HCV core protein could be phosphorylated, albeit inefficiently, independent of its downstream E1 protein in these two cell lines. Two of the basal phosphorylation sites were identified to be serine-53 and serine-116. The phosphorylation of the core protein could be enhanced by the PKC activator phorbol 12-myristic 13-acetate (PMA), and the PKA activator forskolin, and these enhancements could be abolished by the respective inhibitors of PKC and PKA, indicating that the core protein is a substrate of these two kinases. While both serine-53 and serine-116 served as the PKC phosphorylation sites, serine-116 appeared to be the major PKA phosphorylation site. Further analyses using serine-to-alanine mutation to mimic dephosphorylation and serine-to-aspartic acid mutation to mimic phosphorylation revealed that the conversion of serine-116 to aspartic acid led to an enhanced nuclear localization of the core protein. This observation indicates that one function of phosphorylation may be to regulate the nuclear localization of the core protein.