WT1异构体比例转变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响

 目的： 探讨WT1异构体比例改变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响。方法： 逆转录获得人WT1(17AA－/KTS－)异构体全长cDNA序列,连接到PCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒质粒载体上, 酶切和测序证实正确构建重组质粒,建立WT1异构体表达比例改变的单克隆细胞株。MTT法检测细胞增殖活性,形态学观察及Annexin V 检测细胞凋亡。结果： 成功构建了真核表达载体PCDH1-MCS1-EF1-copGFP-WT1(17AA－/KTS－),转染HL-60细胞后,实时荧光定量RT-PCR和Western blotting 显示重组质粒转染细胞中WT1(17AA－/KTS－) mRNA和蛋白水平明显高于空质粒转染组和正常对照组。重组质粒转染细胞的生长抑制率高于空质粒转染组和正常对照组, 差异显著(P<0.05)。加2 μmol/L 三氧化二砷（As2O3）培养48 h后, 形态学观察发现3组细胞都出现了凋亡形态, 但重组质粒转染细胞更为明显。流式细胞术结果显示,As2O3作用24 h后,重组质粒转染细胞凋亡率较空质粒转染组和正常对照组细胞升高,差异显著(P<0.05)。结论： 增加外源性WT1(17AA－/KTS－)异构体的表达能抑制HL-60细胞增殖,促进As2O3 诱导的细胞凋亡。     

HL-60细胞ATRA诱导后MMP-9/TIMP-1表达的变化

为了检测HL-60细胞经过全反式维甲酸(ATRA)诱导后基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2)及金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)表达变化,并探讨其变化的意义。采用瑞氏染色观察细胞形态,WST1实验测定细胞增殖变化,NBT还原实验测定细胞分化状态,RT-PCR方法检测MMP-9、MMP-2、TIMP-1、VEGF的mRNA的表达。结果显示,HL-60细胞经ATRA作用24h后,随着细胞增殖降低与分化的发生,MMP-9mRNA表达增加,TIMP-1mRNA和VEGF表达降低,MMP-2mRNA未见明显表达。ATRA诱导HL-60细胞分化后MMP-9表达增加,而TIMP-1表达降低,MMP-9不促进HL-60细胞表达VEGF。     

IFN-α协同全反式视黄酸诱导HL-60细胞增殖分化及其机制的研究

目的:研究全反式视黄酸(ATRA)与IFN-α联合诱导HL-60细胞增殖分化的作用及其机制。方法:用5×10-7mol/L的ATRA以及2×106U/L的IFN-α单独和联合处理HL-60细胞后,采用POD-原位细胞凋亡检测试剂盒检测HL-60细胞的凋亡,通过计算细胞增殖的抑制率检测HL-60细胞增殖的抑制及诱导分化;用高效液相色谱(HPLC)检测细胞悬液中ATRA的含量;用原位杂交法检测细胞色素CYP26的表达。结果:ATRA和IFN-α均能诱导HL-60细胞分化、抑制其增殖并促进其凋亡,且二者具有明显的协同作用。IFN-α ATRA联合处理组的细胞悬液中,ATRA的水平明显高于单纯ATRA处理组(P<0.05)。ATRA处理组CYP26表达的水平明显高于IFN-α单独处理组(P<0.05)。结论:ATRA IFN-α诱导HL-60细胞的分化具有协同作用。其作用可能是由于IFN-α抑制了HL-60细胞内CYP26的表达,导致ATRA代谢速率减慢,使之保持了有效作用浓度所致。     

视黄酸依赖反义cyclin D1对HL-60细胞分化效应研究

目的 检测视黄酸(Retinoic acid，RA)依赖反义cyclin D1表达载体转染HL-60细胞后启动的诱导分化效应，并探讨其分子机制。方法 成功构建视黄酸依赖反义cyclin D1表达载体，以脂质体转染HL-60白血病细胞，经NBT还原实验、免疫荧光检测CD14表面抗原表达、RT-PCR以及Western blot等方法观测视黄酸处理后细胞分化效应的发生以及Rb基因的mRNA和蛋白表达水平的改变。结果 反义eyelin D1转染和未转染的HL-60细胞经RA处理后，NBT还原能力明显增强、CD14表面抗原表达显著增加，Rb基因的mRNA和蛋白表达水平均有所降低，其中，以反义cyclin D1转染细胞经RA处理后变化更为明显。结论 RA及其诱导的反义cyclin D1可协同诱导HL-60细胞分化成熟，下调Rb基因表达可能是其分子机制之一。     

二十碳五烯酸联合视黄酸对HL-60细胞增殖与

目的研究二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)及其联合视黄酸(retinoicacid,RA)对白血病细胞增殖与分化功能的影响.方法采用MTT法测定细胞增殖功能,NBT还原实验鉴定细胞分化,高效液相色谱法分析细胞内RA代谢.结果与对照组相比,EPA组细胞增殖抑制率为24.38%,RA组为35.74%,EPA+RA组为42.75%;NBT还原实验,EPA+RA组OD值约为对照组的5.9倍,而RA组为2.6倍,EPA组为1.3倍;分析HL-60细胞及其培养介质中RA含量,发现EPA+RA组高于RA组.结论EPA可抑制HL-60细胞增殖和诱导其分化,与RA联合应用能明显增强HL-60细胞的增殖抑制及诱导分化效应,这种联合效应可能与EPA减缓HL-60细胞内RA的代谢相关.     

人胚胎神经干细胞向神经元分化过程中Notch1基因的表达

目的 :探讨Notch1基因在全反式维甲酸 (ATRA)诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用。方法 :用不同浓度 (0 .5、1、5和 10 μmol/L)的ATRA在体外诱导人胚胎神经干细胞 ,7d后 ,做NSE免疫荧光染色 ,计数分化为神经元的比例。用 1μmol/L的ATRA诱导人胚胎神经干细胞 ,于诱导前、诱导 3d和诱导 7d,提取细胞的总RNA ,用半定量RT PCR法检测Notch1基因的表达。结果 :与对照组相比较 ,ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 (P <0 .0 1)。其中 1μmol/L的ATRA诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例最高 ,为 (2 9.2 0± 1.0 9) %。Notch1基因在ATRA诱导后表达明显下调 (P <0 .0 0 1)。结论 :ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 ,Notch1基因在人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中表达量下调     

干扰素对HL-60细胞与维甲酸耐药HL-60细胞作用的研究

目的:探讨干扰素α对HL-60细胞增殖分化与凋亡的作用及特点.方法:MTT法测定细胞增殖性变化.NBT方法测定细胞分化程度.流式细胞仪测定凋亡的发生程度.浓度递增法诱导HL-60细胞的维甲酸耐药性.结果:IFNα体外抑制HL-6 0细胞增殖,并与维甲酸产生协同抑制作用.IFNα可单独诱导HL-60细胞分化,又能增加维甲酸诱导分化作用.单独IFNα无明显的诱导HL-60细胞凋亡作用.维甲酸耐药HL-60细胞经IFNα作用3 d后,可明显恢复其对维甲酸的反应性.结论: IFNα既能促进维甲酸对HL-60细胞的诱导分化作用,又可逆转HL-60的维甲酸耐药性.     

黄芩苷对HL-60白血病细胞的诱导分化作用

目的： 观察中药单体黄芩苷(baicalin) 对人髓系白血病（AML）细胞株HL-60细胞的诱导分化作用。方法: 应用细胞形态学方法、细胞克隆形成试验、流式细胞术分析和NBT还原实验检测黄芩苷诱导HL-60细胞分化的能力。结果: 黄芩苷可诱导HL-60细胞向成熟阶段分化，低浓度黄芩苷可显著抑制HL-60细胞克隆的形成；HL-60细胞经黄芩苷处理后CD11b表达显著增高，CD33表达显著降低；NBT还原实验示黄芩苷处理组的分化成熟细胞阳性率明显高于未加药组。结论: 黄芩苷具有诱导HL-60白血病细胞向成熟粒细胞分化的作用。     

乌苯美司下调c-myc表达与其增强全反式维甲酸诱导NB4细胞

目的： 了解氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）能否增强全反式维甲酸（ATRA）对NB4细胞的诱导分化作用，及此过程中NB4细胞c-myc mRNA表达水平的改变。 方法： MTT法检测药物抑制细胞生长的作用。流式细胞仪测细胞表面分化抗原CD11b及四氮唑蓝（NBT）还原实验检测NB4细胞的分化。RT-PCR检测细胞c-myc mRNA表达水平。 结果： 50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合处理72 h，均能明显增强NB4细胞的NBT还原能力，与10 nmoL/L ATRA组差异显著（P<0.05，P<0.01）。从48 h到96 h，100 mg/L乌苯美司时间依赖性地增强10 nmoL/L ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力，与相应时点10 nmoL/L ATRA组差异明显（P<0.01）。100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合应用72 h，NB4细胞CD11b表达率明显高于10 nmoL/L ATRA组（P<0.01）。50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合处理4 h，NB4细胞c-myc mRNA表达水平明显低于单用ATRA组（P<0.05，P<0.01）；药物联合应用各组NB4细胞的c-myc mRNA表达水平与NBT还原能力之间呈负相关（r=-0.917,P<0.05）。 结论： 乌苯美司可能通过下调NB4细胞c-myc mRNA的表达，从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用。     

二十碳五烯酸联合视黄酸对HL-60细胞增殖与分化功能的影响

目的研究二十碳五烯酸 ( eicosapentaenoic acid,EPA)及其联合视黄酸 ( retinoic acid,RA)对白血病细胞增殖与分化功能的影响。方法采用 MTT法测定细胞增殖功能 ,NBT还原实验鉴定细胞分化 ,高效液相色谱法分析细胞内 RA代谢。结果与对照组相比 ,EPA组细胞增殖抑制率为 2 4 .3 8% ,RA组为 3 5 .74 % ,EPA+ RA组为 4 2 .75 % ;NBT还原实验 ,EPA+ RA组 OD值约为对照组的 5 .9倍 ,而 RA组为 2 .6倍 ,EPA组为 1.3倍 ;分析 HL- 60细胞及其培养介质中 RA含量 ,发现 EPA+ RA组高于 RA组。结论 EPA可抑制 HL- 60细胞增殖和诱导其分化 ,与 RA联合应用能明显增强 HL- 60细胞的增殖抑制及诱导分化效应 ,这种联合效应可能与 EPA减缓 HL - 60细胞内 RA的代谢相关。     

淫羊藿甙抑制肿瘤细胞端粒酶活性及其调节机制的研究

目的 :探讨中药单体淫羊藿甙 (ICA)抑制肿瘤HL 6 0细胞端粒酶活性及作用机制。方法 :采用MTT法 ,NBT染色法 ,TRAP PCR ,RT PCR法和流式细胞术。结果 :ICA显著抑制HL 6 0细胞端粒酶活性 ,且端粒酶活性下降与细胞表面粒细胞分化抗原CD11b表达率呈负相关 ;诱导HL 6 0细胞向粒细胞方向分化 ;改变HL 6 0细胞周期各时相的分布 ,表现为G0 /G1期细胞逐渐增多 ,S期细胞逐渐减少 ;上调分化相关基因p2 1、下调增殖相关基因c mycmRNA和蛋白表达水平。结论 :阐明了ICA显著抑制HL 6 0细胞端粒酶活性 ,并从基因 蛋白 细胞效应水平揭示了其调节端粒酶活性的可能机制。     

Study on the synergic effect of all-trans retinoic acid combined with IFN-alpha on the proliferation and differentiation of HL-60 cells]

AIM: To investigate the synergic effect of all-trans retinoic acid (ATRA) combined with IFN-alpha on the proliferation and differentiation of HL-60 cells. METHODS: HL-60 cell's differentiation and apoptosis were assessed by NBT reduction and TUNEL in situ apoptosis assay kit. CYP26 mRNA expression was detected by in situ hybridization assay kit. Metabolism of ATRA was measured by high performance liquid chromatography. RESULTS: Either IFN-alpha or ATRA induced HL-60 cell differentiation and apoptosis, which was enhanced when combining ATRA with IFN-alpha. The level of ATRA and the expression of CYP26 were higher in HL-60 cells treated with both ATRA and IFN-alpha than in the cells treated with ATRA alone. CONCLUSION: ATRA has remarkable synergic effect with IFN-alpha on HL-60 cells, probably because IFN-alpha inhibits CYP26 mRNA expression and thus reduces the metabolism of ATRA.     

WT1 expression in angiogenic tumours of the skin

AIMS: To determine the expression of WT1 in endothelial proliferations and tumours. Endothelial cells are derived from angioblasts which differentiate into bone marrow stem cells (BMSC). BMSC are characterized by the constitutive expression of the WT1 gene and we have postulated that its expression may be maintained during the differentiation of angioblasts to endothelial cells. METHODS AND RESULTS: The expression of WT1 was studied in human umbilical vein-derived (HUVEC) and brain microvascular endothelial cells (HBME) as well as in a Kaposi sarcoma (KS) cell line in vitro. Forty-two human skin biopsy samples of endothelial proliferations and tumours were analysed for the protein expression of WT1 using the monoclonal antibodies for wt-WT1 (6F-H2) and its 17AA+ variant (2C12). WT1 expression was detectable in HUVEC and KS cells and all WT1 splice variants examined (17AA+/- KTS+/-) were detectable in KS cells, while the 17AA+/- and KTS- variants were present in HUVEC. Immunohistochemical analysis of the 42 human skin biopsy samples revealed cytoplasmic WT1 expression using wild-type specific antibody (6FH2) in microvessels, which is maintained during neoangiogenesis (inflammation, haemorrhage, peritumoral angiogenesis). Around one-third of haemangiomas (3/10) and non-HIV-Kaposi sarcomas (7/18) expressed the WT1 protein in the cytoplasm of tumour cells compared with its frequent expression in angiosarcomas (7/8) using the same antibody (6FH2). The nuclear 17AA+ isoform of WT1 was detectable at protein level in a small proportion of KS cases exclusively (3/7). CONCLUSION: Our data suggest that WT1 protein expression is maintained during angiogenesis and malignant transformation of endothelial cells and can be considered as a new endothelial marker.     

HL-60细胞双向分化过程中表面膜抗原的变化

RA和TPA能在体外诱导人的急性早幼粒白血病细胞系HL-60向成熟粒样细胞和单核-巨噬样细胞双向分化。本实验经细胞形态观察、α-NAE细胞化学染色和NBT还原反应证明。用间接免疫荧光法和FACS分析,诱导的HL-60细胞与国产十四种单克隆抗体的结合反应表明,其中六种单克隆抗体可以判定HL-60细胞分化方向。     

抗人DR5单克隆抗体诱导HL-60细胞凋亡机制

探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导白血病细胞系HL-60细胞凋亡的可能机制。MTT法检测mDRA-6对HL-60细胞的生长增殖的影响,以及Caspase 8、10、3抑制剂对mDRA-6抑制HL-60细胞生长增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测HL-60细胞DNA片断化降解;Western blot检测mDRA-6对HL-60细胞Caspase 8、10、3的激活改变。结果发现,mDRA-6呈时间、浓度依赖性地抑制HL-60细胞的生长增殖,10 mg/L的mDRA-6作用HL-60细胞6 h、8 h和10h,细胞增殖抑制率分别为23.96%、44.10%和50.28%;琼脂糖凝胶电泳显示,10 mg/L的mDRA-6作用6 h,HL-60细胞呈现凋亡细胞特有的DNA梯形条带;Western blot检测结果发现,mDRA-6作用HL 60细胞不同时间,Caspase 8均只有酶原条带出现,无激活片段产生,而Caspase 10和Caspase 3显示明显裂解片段产生,并随mDRA-6作用时间延长而增多;预先使用15μmol/L的Caspase 10及Caspase 3抑制剂孵育细胞1 h,能够使mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率分别降低64.15%(t=10.13、P<0.01)和53.69(t=8.93、P<0.01)%,而预先使用15μmol/L的Caspase 8抑制剂孵育细胞1 h,mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率仅降低4.40%(t=0.52、P>0.05)。以上实验结果提示,mDRA-6通过激活Caspase 10启动凋亡信号分子,诱导白血病HL-60细胞凋亡。     

The Wilms tumor suppressor WT1 regulates early gonad development by activation of Sf1

In mammals, several genes including the Wilms tumor suppressor gene Wt1, the Lim homeobox gene Lhx9, and the gene encoding steroidogenic factor 1 (Sf1) have been implicated in the development of the indifferent gonad prior to sexual differentiation. Interactions among these genes have not yet been elucidated. Using biochemical and genetic experiments, we demonstrate here that WT1 and LHX9 function as direct activators of the Sf1 gene. Interestingly, only the -KTS form of WT1 is able to bind to and transactivate the Sf1 promoter. This observation is consistent with differential roles for the -KTS and +KTS variants of WT1 which have been postulated on the basis of human disorders such as the Frasier syndrome. Our data suggest a pathway in which the products of the Wt1 and Lhx9 genes activate expression of Sf1 and thus mediate early gonadogenesis.