不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响

目的:研究不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响,建立一种简单有效的核移植方法.方法:以小鼠卵丘细胞作为体细胞核移植的供核细胞,采用4种去核方法(盲吸法、蔗糖辅助去核法、化学去核法、荧光染色去核法)研究卵母细胞去核率的差异,并比较胞质内注射法和反向核移植法应用于小鼠体细胞核移植的效果.结果:荧光染色法的去核率(88%)显著高于其他试验组(P<0.05),但囊胚率和囊胚细胞数与蔗糖辅助去核法无明显差异(P>0.05);胞质内注射法构建重构胚的效率与反向核移植法相似(P>0.05),但胞质内注射法的囊胚率和囊胚细胞数较反向核移植高(P<0.05).结论:荧光染色去核法和胞质内注射法构建体细胞核移植胚胎效率较高,可维持胚胎早期发育.     

不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响，寻找最佳电融合参数。方法 将直径10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核一卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者问的融合，并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4～8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动，变动范围分别是电场强度1000-2000kV／cm和脉冲时程40～160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核一卵母细胞复合体的融合率．而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内，供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异，并且融合后重组胚的激活，以及发育至2细胞、4～8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外，脉冲重复次数以1～2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。     

不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找最佳电融合参数。方法 将直径10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者间的融合,并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4~8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动,变动范围分别是电场强度1000~2000kV/cm和脉冲时程40~160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核-卵母细胞复合体的融合率,而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内,供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异,并且融合后重组胚的激活,以及发育至2细胞、4~8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外,脉冲重复次数以1~2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

[目的]观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育.[方法]昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞.成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.[结果]卵子去核存活率为75.9%(362/477),注核存活率为39.8%(143/359),D1存活率为38.4%(138/359).39.9%(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核,其卵裂率为80.7%(46/57).大部分重构胚发育到2～3细胞停滞,其中2个分裂至4细胞,无囊胚形成.[结论]将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中,可以诱导极体排出,形成2原核 1极体的重构胚胎.重构胚胎大部分发育到2～3细胞即发生停滞,最多到达4细胞期,发育潜能差.     

猪体细胞核移植胚的体外发育及其影响因素

以卵丘细胞为核供细胞组成重构胚 ,卵裂率达以5 6 .7% ,发育至桑椹胚达 11.7%、孵化囊胚率为 6 .7% ,显著高于成纤维细胞重构胚 (P<0 .0 5 )。作者还研究了卵母细胞的采集方法、激活程序和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响 ;以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至 G0或 G1期 ,抽吸法 /解剖法采集卵母细胞 ,体外培养 33或 4 4 h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中 ,重构胚以钙离子载体 A2 3817或电脉冲结合6 - DMAP激活处理 ,体外培养 6 d,结果表明 ,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素 (CB)、激活程序并不影响重构胚的发育 (以…     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

【目的】观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育。【方法】昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞。成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入，观察其受精和胚胎发育情况。【结果】卵子去核存活率为75．9％(362／477)，注核存活率为39．8％(143／359)，D1存活率为38．4％(138／359)。39．9％(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核，其卵裂率为80．7％(46／57)。大部分重构胚发育到2-3细胞停滞，其中2个分裂至4细胞，无囊胚形成。【结论】将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中，可以诱导极体排出，形成2原核 1极体的重构胚胎。重构胚胎大部分发育到2-3细胞即发生停滞，最多到达4细胞期，发育潜能差。     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质。随后,将直径为10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活。体外培养72h,对重组胚发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s;Hoechst33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核;去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出．再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体．纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核．卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合．并对重组胚激活。体外培养72h．对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95．5％，注核成功率为76．7％，供体核．卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2％和62.2％；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4-8细胞和桑椹胚期的比率分别为57．5％、39．1％和27．6％；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小．是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

Bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体形态学变化

目的研究野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体显微和超微结构变化。方法用扫描电镜和光镜对诱导排卵后野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体结构上的变化进行观察。结果 （1）光镜显示,野生型小鼠中,卵丘细胞紧密围绕在卵母细胞周围;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞松散地分布在卵母细胞周围。（2）电镜显示,野生型小鼠可见大量的纤维网格状结构,卵丘细胞亦可见;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞之间未见有网状结构,卵丘细胞紧密连接少。（3）bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞数明显低于野生型。结论 bikunin基因敲除小鼠卵丘细胞之间、卵丘细胞与卵母细胞之间结构发生变化,卵丘-卵母细胞数明显下降,该现象可能与卵丘-卵母细胞复合体的功能密切相关。     

小鼠体细胞核移植的早期研究

目的 建立成熟的小鼠体细胞核移植技术。方法 通过显微操作，以ICR鼠成纤维细胞核和C57鼠的去核卵母细胞进行胚胎的重构。重构胚经化学激活或3种不同脉冲电压融合后再经体外或输卵管体内培养；3d后回收胚胎并进行胚胎的发育鉴定。结果 去核卵母细胞的成活率为71．91％、化学激活率为75．09％；刺激电压为60V(80μs、刺激5次)的融合率比其他几种方式高；经脉冲电压70V(80μs、刺激2次)处理后的胚胎发育潜力比其他几种方式处理后的胚胎发育潜力要好。结论 小鼠体细胞核移植技术基本获得成功。     

卵丘细胞线粒体移植对年老小鼠早期胚胎发育的影响

目的探讨线粒体对早期胚胎发育的影响。方法采用昆明小鼠为动物模型,以其卵丘颗粒细胞、卵母细胞、受精卵为试验材料,提取年老小鼠卵丘细胞线粒体,将其注入年老小鼠卵母细胞和体内冲出的受精卵中。结果与结论通过卵丘细胞线粒体移植,给卵子补充了一定量的线粒体,可以部分弥补卵母细胞因变异引起的功能不足。为第2次减数分裂、受精卵和胚胎发育提供足够的能量,明显改善了胚胎的质量。     

注核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的 :探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠 -小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响。方法 :采用血清饥饿法同步化处理的 SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞 ,常规超排 KM小鼠获得卵母细胞 ,采用盲吸法去核 ,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎 ,6- DMAP+ CCB+乙醇激活重组胚 ,CZB培养液中培养。结果 :电场强度 ( V/cm)和脉冲 ( ms)为 :1 5 0 0 /30 ;1 5 0 0 /40 ;1 80 0 /30 ;1 80 0 /40时 ,融合率为 :81 .5 % ;83.3% ;77.6% ;82 .0 %。直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为 33.1 %和 2 8.9% ,桑椹胚发育率为 1 7.8%和 1 5 .5 %。结论 :电场强度为 1 5 0 0～ 1 80 0 V/cm,脉冲为 30 ms或 40 ms时 ,都能获得较高的融合率 ;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高 ,但统计学分析差异不显著     

核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响.方法采用血清饥饿法同步化处理的SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞,常规超排KM小鼠获得卵母细胞,采用盲吸法去核,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎,6-DMAP+CCB+乙醇激活重组胚, CZB培养液中培养.结果电场强度(V/cm)和脉冲(ms)为 1500/30; 1500/40; 1800/30; 1800/40时,融合率为 81.5%; 83.3%; 77.6%; 82.0%.直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为33.1%和28.9%,桑椹胚发育率为17.8%和15.5%.结论电场强度为1500～1800V/cm, 脉冲为30ms或40ms时,都能获得较高的融合率;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高,但统计学分析差异不显著.     

ICR小鼠卵母细胞通过旁分泌机制促进排卵关键过程

目的:利用国内医学研究常用ICR品系小鼠,在构建用于研究卵母细胞-卵丘细胞交互作用培养模型的基础上,研究卵母细胞及其产生的旁分泌因子生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)对排卵过程中的关键事件——卵丘扩展的调控作用?方法:通过显微手术制备摘除卵母细胞后的卵丘细胞复合体(OOX),并通过与卵母细胞共培养或GDF9和BMP15 处理研究卵母细胞及其特异释放的旁分泌因子对表皮生长因子(EGF)诱导卵丘扩展过程的调控?结果:成功构建了ICR小鼠OOX培养模型,发现卵母细胞及其释放的旁分泌因子GDF9和BMP15为EGF诱导卵丘扩展所必需?结论:ICR小鼠卵母细胞通过旁分泌机制促进排卵关键过程?     

浅谈甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的毒性作用

目的:观察MXC对未成熟小鼠卵母细胞体外成熟的毒性作用;方法:1、用不同浓度MXC培养液培养未成熟小鼠卵母细胞;对照组直接用M2培养液培养,各组培养时间均为24h。2、激光共聚焦观察有丝分裂纺锤体的形成。3、培养结束时,在镜下观察MXC对卵丘扩展的影响。结论:MXC对小鼠卵母细胞的毒性作用可通过直接作用于卵母细胞,使其有丝分裂纺锤体形成异常,从而抑制卵母细胞核的成熟。还可能通过抑制卵丘细胞的扩展,来影响成熟卵母细胞质量,进而影响后续胚胎发育,造成流产。     

小鼠卵丘-卵母细胞复合体CD44和间α胰蛋白酶抑制剂的表达

目的探讨CD44和间α胰蛋白酶抑制剂（ITI）在小鼠卵丘-卵母细胞复合体的表达及两者的相关性.方法应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重染色技术观察小鼠卵丘-卵母细胞复合体中CD44和ITI的分布.结果ITI在小鼠卵丘细胞外基质之间呈阳性表达,CD44存在于卵丘细胞膜表面.结论CD44和ITI的阳性表达可能在卵丘-卵母细胞复合体成熟中起重要作用.     

透明质酸对小鼠卵丘细胞外基质的影响

目的 观察透明质酸(HA)对小鼠卵丘细胞外基质的影响。方法 取3～4周龄的雌鼠(含野生型和bikunin基因敲除小鼠)诱导排卵，取卵丘-卵母细胞复合体(COC)，镜下计数诱导排卵后卵母细胞。免疫荧光双重染色后观察HA及血清来源的HA相关蛋白(SHAP)在卵丘细胞外基质的分布。结果 SHAP-HA复合体缺失引起卵丘细胞外基质的变化，并影响到随后的排卵。结论 SHAP-HA参与卵丘细胞外基质的构建．细胞外基质的受损引起卵母细胞功能的破坏。     

人卵母细胞成熟过程中卵丘细胞与卵母细胞关系的研究进展

人卵母细胞和卵丘细胞（cumulus cell, CC）之间存在双向通讯,在卵泡内,卵母细胞的发育高度依赖于与卵丘细胞的联系。卵母细胞通过分泌有效的生长因子（oocyte-secreted factors, OSFs）介导卵丘细胞分化,卵丘细胞则通过缝隙连接传递信号并在卵泡发育的后期阶段支持卵母细胞的生长,进一步促进卵母细胞成熟和受精。本文将综述人卵母细胞成熟中卵丘细胞与卵母细胞之间的重要关系及有关作用机制,为提高体外成熟（IVM）技术中卵母细胞的质量提供新的帮助。     

人卵母细胞与体细胞的电融合效率

目的探索适合于人体细胞核移植的电融合参数,并比较不同类型和数目体细胞的电融合效率。方法首先对体外授精(IVF)后的低评分胚胎行电融合,观察不同电融合参数下胚胎的融合及继续发育情况,确定最适电融合参数;其次将1～2个颗粒细胞或成纤维细胞置入IVF后未受精卵子的卵周隙(PVS)中,在最适电融合参数下行电融合。结果在两段交流脉冲间给予200 V、25μs的直流脉冲为本研究的最适电融合参数;颗粒细胞与卵母细胞的电融合效率低于成纤维细胞(P<0.05);在PVS中加入2个颗粒细胞,其单个颗粒细胞的电融合效率高于加入1个颗粒细胞(P<0.05),而成纤维细胞则无差异。结论低融合效率的体细胞与卵母细胞电融合时可通过增加PVS中体细胞的数目来提高融合效率。     

人卵母细胞与体细胞的电融合效率

目的 探索适合于人体细胞核移植的电融合参数,并比较不同类型和数目体细胞的电融合效率.方法 首先对体外授精(IVF)后的低评分胚胎行电融合,观察不同电融合参数下胚胎的融合及继续发育情况,确定最适电融合参数;其次将1～2 个颗粒细胞或成纤维细胞置入IVF后未受精卵子的卵周隙(PVS)中,在最适电融合参数下行电融合.结果 在两段交流脉冲间给予200 V、25μs的直流脉冲为本研究的最适电融合参数;颗粒细胞与卵母细胞的电融合效率低于成纤维细胞(P＜0.05);在PVS中加入2个颗粒细胞,其单个颗粒细胞的电融合效率高于加入1个颗粒细胞(P＜0.05),而成纤维细胞则无差异.结论 低融合效率的体细胞与卵母细胞电融合时可通过增加PVS中体细胞的数目来提高融合效率.