荧光免疫层析技术检测寨卡病毒IgG抗体

目的建立和开发一种高特异性、高灵敏度的寨卡病毒IgG抗体的检测方法。方法本研究对寨卡病毒E蛋白核酸序列优化,减低其交叉反应,经过大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化获得特异性蛋白。将获得的寨卡病毒E蛋白抗原喷于检测区捕获样品中的目标抗体,将羊抗小鼠IgG喷于控制区进行质量控制;将鼠抗体人IgG单克隆抗体标记荧光纳米颗粒(激发谱峰365 nm;发射光谱峰610 nm)作为标记抗体;建立荧光免疫层析试剂,配合荧光免疫检测仪YG10,检测人血清中的寨卡病毒IgG抗体,并对该检测方法进行性能验证。结果寨卡病毒E蛋白经大肠杆菌表达,菌液经过收集并超声后,上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定,多存在于沉淀中;纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,均呈现较单一的蛋白条带,纯度达到90%以上。建立的荧光层析试剂检测50份正常人血清,荧光免疫检测仪YG1分别扫描读取T、C信号值,读取T/C值,计算平均值(AVERAGE)和标准差(STDEVP),3倍标准差加上平均值作为阳性判断值,即:T/C≥3SD+AVG为阳性;与对比试剂ZIKV IgG酶联免疫试剂盒(Dia.Pro.)同时检测3份寨卡阳性标本均为阳性反应;10份正常人血清均为阴性反应;批内重复性CV≤20%,批间重复性CV≤15%;与相似的蚊媒病毒基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒均无交叉反应。结论该荧光层析试剂具有较好的灵敏性和特异性,可作为人血清、血浆、全血样本中寨卡病毒IgG抗体的快速筛查。     

寨卡病毒NS1单克隆抗体制备及其在临床诊断中的应用

目的 用寨卡病毒非结构蛋白NS1免疫小鼠并制备鼠源单克隆抗体,建立捕获ELISA方法检测寨卡病毒NS1蛋白.方法 合成NS1基因序列构建真核表达载体pcDNA3.1-NS1,转染HEK293细胞收集上清,经Ni+柱亲和层析法纯化NS1蛋白.以纯化的NS1重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取脾脏进行细胞融合,筛选阳性细...     

建立核酸序列依赖性扩增方法检测寨卡病毒

目的 建立检测寨卡病毒的核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,满足口岸需要.方法 根据寨卡病毒NS3基因设计并验证特异性扩增引物,建立NASBA方法.用登革病毒、基孔肯雅病毒、乙脑病毒、黄热病毒作为对照验证方法的特异性;用不同浓度寨卡病毒RNA进行NASBA扩增,确定方法的灵敏度.结果 以寨卡病毒RNA为模板扩增获得N...     

一例基孔肯雅病毒和寨卡病毒混合感染病例的发现

目的 对来自菲律宾的入境旅客（1例发热病例）进行病原体鉴定。方法 采集病例血液样本,提取核酸后进行基孔肯雅病毒和寨卡病毒荧光RT-PCR检测,进而接种Vero细胞分离培养病毒,细胞培养上清用荧光RT-PCR方法和宏基因组序列测定分析法进行病毒鉴定。结果 荧光RT-PCR检测结果显示,该病例存在基孔肯雅病毒和寨卡病毒感染,Ct值分别为20和26;血清样本接种Vero细胞72 h后可观察到明显的细胞病变效应,细胞培养上清的荧光RT-PCR检测和病毒宏基因组测序分析结果显示,Vero细胞中有基孔肯雅病毒和寨卡病毒。结论 该病例为基孔肯雅病毒和寨卡病毒混合感染病例。     

甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白HA1真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白(HA1)的真核表达载体,并表达其编码蛋白HA1。方法利用RT-PCR技术扩增HA1基因,克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T-HA1质粒。双酶切pMD18-T-HA1与PXJ40后回收并连接回收片段,构建PXJ40-HA1真核表达载体,鉴定后转染293T细胞,用免疫印迹法(western-bolt)鉴定重组HA1蛋白的表达。结果实验成功构建HA1基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达出分子量为40kD的重组蛋白。结论成功构建的甲型流感病毒SwH1N1HA1基因的真核表达载体,可为后期的流感快速检测及基因工程疫苗的制备奠定良好的基础。     

广东地区蝙蝠携带登革热病毒、寨卡病毒以及狂犬病病毒的流行病学调查

目的 了解广东地区蝙蝠携带狂犬病病毒、寨卡病毒以及登革热病毒情况。方法 2014-2016年分别在广州市和湛江市部分地区采集蝙蝠,取其血清和脑组织标本,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）、巢式聚合酶链反应（nested polymerase chain reaction,Nested PCR）,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和细胞培养分离检测所采标本中的狂犬病病毒、登革热病毒和寨卡病毒的感染情况。结果 采集蝙蝠共174只,分属2科3个种：果蝠科的犬蝠属（Cynopterus sphinx）33只、蝙蝠科的普通伏翼属（Pipistrellusabramus）9只及高头蝠属（Scotophiluskuhlii）132只。分别取得血清、脑组织各174份。在犬蝠脑标本中检出登革热病毒阳性1份,阳性率0.06%（1/174）,寨卡病毒、狂犬病病毒均未检出。结论 广东两个地区的3种蝙蝠作为寨卡病毒、登革热病毒和狂犬病病毒宿主的可能性较小。     

寨卡病毒包膜蛋白重组人腺病毒5型载体的构建与免疫原性测定

目的 以腺病毒5型载体（Ad5）构建含寨卡病毒（ZIKV）包膜蛋白（prM-E）的复制缺陷型5型重组腺病毒（rAd5）表达载体,测定prM-E在细胞中的表达及对小鼠的免疫原性。方法 从ZIKV毒株Z16006（亚洲型）分离获得prM-E基因片段,以重组腺病毒AdMax^TM系统包装重组腺病毒rAd5/prM-E。选用C57BL/6小鼠,以rAd5/prM-E 10⁷、10⁸和10⁹ PFU三个剂量肌内注射免疫小鼠,在第3周同等剂量加强免疫一次,第5周从小鼠眼球取血并分离脾淋巴细胞。分别以ELISpot和ELISA方法测定小鼠对ZIKV prM-E的体液与细胞免疫反应。结果 成功构建复制缺陷型重组腺病毒载体rAd5/prM-E,采用Western blot方法和抗ZIKV E抗体检测rAd5/prM-E感染的293A细胞表达产物,可见与E蛋白相应的56 kDa蛋白带。以ELISpot方法测定小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ分泌细胞形成斑点数（SFCs）,结果分别为（688.54±186.43）、（1 084.90±144.14）和（1 640.20±147.13） SFCs/10⁶脾细胞,与病毒接种剂量呈正比关系;采用ELISA测定免疫小鼠血清中抗E抗体,其滴度（log10值）分别为（3.14±0.39）、（3.50±0.30）和（3.74±0.25）, 均高于对照组小鼠（0.80±0.17）,差异具有统计学意义（P<0.001）。结论 rAd5/prM-E具有感染小鼠并诱导小鼠产生强烈的特异性抗体和细胞免疫反应的能力,表明prM-E具有良好的免疫原性,为ZIKV候选疫苗研制提供了可靠的免疫源。     

苍白密螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析

目的 表达苍白密螺旋体(梅毒螺旋体)黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲合层析柱纯化重组蛋白,Western-印迹检测其免疫反应性.结果 成功构建了PET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子量约为26×103的融合蛋白,其表达产物占全菌总蛋白的＞30%,并且主要可溶性形式存在;Western-印迹检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白为可溶性蛋白,且具有良好的免疫反应性,为进一步研究其在Tp0751黏附蛋白在梅毒致病过程中的作用和其生物学功能奠定了基础.     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

Status of natural infection with Japanese encephalitis virus in Japan: Prevalence of antibodies to the nonstructural 1 protein among humans and horses

The literature on natural infections with Japanese encephalitis virus in Japan and subclinical:clinical infection rates was summarized. To detect natural infections, conventional serologic methods were used in the past, while nonstructural 1 protein-based methods have been used recently. Annual infection rates in humans and horses indicated the status of natural virus activity in Japan.     

Immunization of Zika virus envelope protein domain III induces specific and neutralizing immune responses against Zika virus

In this study, we described the generation and immunogenicity of the Zika Virus (ZIKV) envelope protein (E) domain III (DIII) as a protein subunit vaccine candidate. ZIKV EDIII (zEDIII) was rapidly produced in E. coli in inclusion bodies. ZIKV EDIII was solubilized, refolded and purified to >95% homogeneity with a one-step Ni²⁺ affinity chromatography process. Further analysis revealed that zEDIII was refolded properly and demonstrated specific binding to an anti-zEDIII monoclonal antibody that recognizes a zEDIII conformational epitope. Subcutaneous immunization of mice with 25 and 50 μg of zEDIII was performed over a period of 11 weeks. zEDIII evoked ZIKV-specific and neutralizing antibody response with titers that exceed the threshold that correlates with protective immunity against ZIKV. The antigen-specific IgG isotypes were predominantly IgG1 and splenocyte cultures from immunized mice secreted IFN-gamma, IL-4 and IL-6. Notably, zEDIII-elicited antibodies did not enhance the infection of dengue virus in Fc gamma receptor (FcγR)-expressing cells. This study provided a proof of principle for the further development of recombinant protein-based subunit vaccines against ZIKV.     

中国大陆第三例输入性寨卡病毒病病例调查分析

目的 对中国大陆第三例输入性寨卡病毒病病例进行调查分析,为防控寨卡病毒病提供工作经验和参考依据。方法 对中国大陆第三例输入性寨卡病毒病病例的临床表现、实验室检测、诊疗和流行病学调查进行描述性分析。结果 2016年2月19日,经中国CDC有关专家复核和专家会诊,我国义乌市确诊1例从斐济、萨摩亚旅游归来的输入性寨卡病毒病病例,病例曾在萨摩亚有蚊虫叮咬史。病例2月14日发病,15日出疹,16日出现结膜炎,16日收住入院,17日体温正常,19日皮疹消失,20日结膜炎消失。血液中寨卡病毒核酸检测阳性持续仅3 d,血液核酸检测阴性4 d后尿液仍可检测到核酸阳性。结论 该病例寨卡病毒病症状典型,早期可采集病例血液进行寨卡病毒核酸检测,体温正常后应采集尿液进行寨卡病毒核酸检测。     

中国大陆首例输入性寨卡病毒病病例调查分析

目的 分析2016年2月9日中国大陆首例确诊寨卡病毒病病例的流行病学特征,为防控寨卡病毒病提供参考依据。方法 对中国大陆首例确诊寨卡病毒病病例进行流行病学调查并临床观察病例同行者与接触者。采集病例血清、尿液等标本,应用荧光定量RT-PCR进行核酸检测。结果 该病例确诊为寨卡病毒病,于第18病日解除隔离、痊愈出院。病例第10病日血清标本和第11~13病日尿液标本检测均为寨卡病毒核酸阳性。该病例系江西省赣县籍外派工作回国人员,发病前在寨卡病毒流行地区有蚊虫叮咬史,同行者与接触者医学观察期内均未出现寨卡病毒病症状。结论 该病例为中国大陆首例寨卡病毒感染确诊病例,系境外输入性病例,感染来源与在寨卡疫源地委内瑞拉蚊虫叮咬有关。     

寨卡病毒感染人神经母细胞瘤细胞所诱导的细胞因子表达水平变化

目的 研究寨卡病毒（ZIKV）感染人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）所导致的细胞因子分泌的变化,探讨ZIKV影响神经系统功能紊乱的机制。方法 建立ZIKV感染SH-SY5Y细胞模型,采用噻唑蓝（MTT）分析法检测细胞活力,采用悬浮芯片系统（Bio-Plex^® 200）Luminex多重检测技术同时定量检测24、48、72 h细胞培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18、IFN-γ、TNF-α、IL-12P70、GM-CSF的浓度。结果 病毒感染组24、48、72 h细胞存活率均低于正常对照组（均P<0.01）。病毒感染组（24~72 h）分泌IL-1β、IL-5、IFN-γ、TNF-α、IL-12P70、GM-CSF的浓度水平均高于对照组（均P<0.01）。病毒感染组（48 h）分泌的IL-1β、IL-12P70、GM-CSF浓度水平均高于对照组（48 h）,病毒感染组（72 h）分泌TNF-α高于对照组（72h）（P<0.05或P<0.01）。结论 ZIKV感染SH-SY5Y细胞后致其细胞存活率降低,并以时间依赖的方式分泌浓度水平相对较高的促炎性细胞因子。     

寨卡病毒病流行病学概述

寨卡病毒病是一种由寨卡病毒引起的,主要通过伊蚊传播的新发急性病毒性传染病,尚无疫苗和特异性治疗药物。为了加强对寨卡病毒病流行病学特征的了解,本文通过Medline数据库检索寨卡病毒病相关信息,结合相关政府部门、国际卫生组织报告等资料对寨卡病毒病流行病学特征进行综述。目前,该病主要在美洲地区流行,呈快速蔓延之势,34个国家存在病毒本地传播,多个国家报告输入病例。该病临床表现通常较轻,死亡罕见,部分病例可出现神经系统综合征,婴儿出生缺陷等较严重的后果,引起国际社会广泛关注,中国存在因输入病例引发的疫情局部扩散的风险。但该病是一种可防可控的传染病,只要各项策略和措施落实到位,就能够有效控制疫情扩散。     

寨卡病毒疫情及研究进展

自2015年5月以来,寨卡病毒疫情引起全球的高度关注。寨卡病毒是一种黄病毒,存在非洲型和亚洲型两个亚型。主要通过伊蚊传播,也可通过血液、母婴和性传播。潜伏期3~12天,临床主要表现斑丘疹、发热、关节/肌肉酸痛等。寨卡病毒最早发现于1947年。2015年5月起,在巴西等美洲国家出现大规模暴发流行,并不断蔓延至全球59个国家。研究表明,巴西密集出现的新生儿小头症病例和其他神经系统病变可能与寨卡病毒存在密切关系,寨卡病毒全基团序列已公布,并有多个突变位点。目前尚无有效疫苗预防寨卡病毒感染,主要预防措施为防蚊控蚊和提高个人防护意识。