TRPC1/STIM1复合体调节人脐静脉内皮细胞钙池操纵性钙通道和受体操纵性钙通道介导的钙内流和NO生成

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/基质交联分子1(STIM1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)钙池操纵性钙通道(SOCC)和受体操纵性钙通道(ROCC)介导的钙内流和NO生成中的作用。方法取2~3代HUVEC,将构建的TRPC1和STIM1干扰质粒分别转染HUVEC,观察细胞转染效果的同时采用real-time PCR和Western blot检测TRPC1、STIM1 mRNA和蛋白的表达。将细胞分别与钙敏感受体(CaR)激动剂精胺、ROCC模拟剂(TPA)+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220及经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育后,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca2+]i和NO生成的变化;随后用TRPC1和STIM1干扰质粒同时转染HUVEC,与精胺孵育后检测[Ca2+]i和NO生成,免疫共沉淀法检测TRPC1和STIM1的相互作用。结果与Control组相比,TRPC1转染组和STIM1转染组TRPC1、STIM1 mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.05);在四种不同处理作用下,TRPC1转染组和STIM1转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P0.05);与Control组、TRPC1转染组及STIM1转染组相比,TRPC1和STIM1共转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P0.05);TRPC1与STIM1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的剌激下作用增强。结论 TRPC1/STIM1复合体共同调节CaR经SOCC和ROCC激活介导的钙内流和NO生成。     

钙离子信号蛋白TRPC1及Orai1参与了HUVEC经SOC和ROC介导的钙内流和NO生成

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)及钙释放激活钙通道调节分子1(Orai1)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)经钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导的Ca2+内流和一氧化氮(NO)生成中的作用。方法取2~3代HUVEC进行随机分组,将构建的TRPC1、Orai1干扰质粒(sh TRPC1、sh Orai1)分别转染入HUVEC,采用real-time PCR和Western blot检测TRPC1、Orai1 mRNA和蛋白的表达及转染抑制效率。将各组细胞分别与钙敏感受体(CaR)激动剂精胺、ROC模拟剂(TPA)+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220与经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育后,荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca2+]i和NO生成的变化。结果与对照组比较,sh TRPC1组和sh Orai1组mRNA表达(抑制率分别为84.50%、76.10%)和蛋白的表达(抑制率分别为83.98%、71.73%)明显降低(P0.05)。在4种不同药物作用下,sh TRPC1组和sh Orai1组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P0.05)。结论 TRPC1、Orai1参与了人脐静脉内皮细胞SOC和ROC介导的钙内流和NO生成。     

SOCE通道在消化系肿瘤中的研究进展

钙库操纵性钙离子内流(store-operated calcium entry,SOCE)是介导胞外Ca2+进入细胞内的重要通道之一.其核心蛋白是位于内质网上的基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)及位于细胞膜上的钙释放激活钙通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1,CRCM1/Orai1).随着研究的不断深入,SOCE通道在肿瘤中的作用机制逐渐阐明并加以完善,同样在消化系肿瘤中SOCE通道也发挥了重要作用.本文重点对SOCE通道基本信息、及其在消化系肿瘤中研究概况进行综述,并初步分析其作用机制.     

体外高糖环境对H9c2心肌细胞中STIM1、Orai1及TRPC1的影响

目的构建体外高糖诱导的心肌损伤模型,观察体外高糖环境对H9c2心肌细胞的增殖以及基质作用分子1(STIM1)、Orai1和瞬时受体电位通道1(TRPC1)表达的影响。方法体外培养鼠胚H9c2心肌细胞,随机分为4组,正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高渗组(27.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(33mmol/L葡萄糖),药物组(2μmol/L SKF96365+33 mmol/L葡萄糖)。培养72 h。采用CCK8技术检测细胞增殖率;采用RT-PCR以及Western blotting技术测定4组STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果正常对照组和高渗组STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义(P均0.05);高糖组STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相对表达量较正常对照组增加(P均0.05);药物组的表达量较正常对照组高(P均0.05),较高糖组下降(P均0.05)。结论体外高糖在一定程度上抑制心肌细胞增殖,促进STIM1、Orai1及TRPC1蛋白的表达,这可能是体外高糖环境下H9c2心肌细胞损伤的机制之一。     

STIM1/Orai1可能是防治缺血性脑血管病的新靶点

近年来,通过RNA干扰技术在果蝇细胞中鉴定出钙离子释放激活钙通道(Ca2+ releaseactivated calcium channel,CRAC)的2种重要组成蛋白,即位于内质网上的Ca2+感受器间质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)和位于细胞膜上的CRAC通道蛋白Orai1.研究表明,STIM1和Orai1对血管平滑肌细胞、血小板、血管内皮细胞等多种细胞均有调控作用,在血管平滑肌细胞表型转化、止血、血栓形成、新生血管发生等方面发挥着重要作用,显示两者可能与缺血性脑血管病密切相关.文章就STIM1和Orai1蛋白在缺血性脑血管病方面的研究进展进行了综述,以探讨STIM1和Orai1作为防治缺血性脑血管病的新靶点的可能性.     

重组腺病毒载体敲减ApoE~(-/-)小鼠血管平滑肌细胞Orai1基因模型的构建

目的:为探讨Orai1基因在动脉粥样硬化进展中的作用,通过重组腺病毒载体建立ApoE~(-/-)小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Orai1基因的敲低模型,为深入相关研究奠定基础。方法:构建针对小鼠Orai1基因的重组腺病毒载体。高脂饲养ApoE~(-/-)小鼠至16周龄后处死。取胸主动脉原代VSMCs改为体外培养,细胞分为三组,分别为shOrai1组、shNC组和对照组。转染后通过实时定量聚合酶链式反应(qPCR), Western blot检测Orai1表达水平,同时对转染模型进行验证。结果:qPCR示,重组腺病毒在ApoE~(-/-)小鼠VSMCs中Orai1基因的干扰效率达57%,Western blot结果示,Ad-GFP-Orial-shRNA转染组Orai1蛋白表达水平显著降低。结论:通过成功建立ApoE~(-/-)小鼠VSMCs中Orai1基因敲低模型,从而为阐明钙库操纵性钙通道在动脉粥样硬化进程中的作用,尤其关于斑块延展和不稳定的相关性研究奠定了基础。     

基质交感分子1对大鼠内皮祖细胞细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰技术沉默基质交感分子1(STIM1)基因后对内皮祖细胞(EPC)细胞周期的影响.方法 实验分为腺病毒阴性对照组(NSC组)、大鼠STIM1干扰腺病毒载体转染组(si/rSTIM1组)及大鼠STIM1干扰腺病毒载体与人重组STIM1腺病毒载体共转染组(si/rSTIM1+hSTIM1组).分离培养大鼠骨髓源性EPC,用构建好的STIM1干扰腺病毒载体和人重组STIM1腺病毒载体进行转染后,采用逆转录PCR检测细胞基质交感分子1表达,流式细胞技术检测细胞周期,激光共聚焦测量钙离子浓度,免疫共沉淀检测STIM1与瞬时受体电位通道1(TRPC1)之间的相互作用.酶联免疫吸附测定法检测大鼠1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)含量.结果 细胞转染后48 h,si/rSTIM1组细胞内STIM1 mRNA表达明显低于NSC组 (0.37±0.02比1.00±0.02,P<0.05),钙离子浓度低于NSC组(34.07±4.10 比86.51±14.12,P<0.05),EPC的细胞周期停止在G1期[si/rSTIM1组:(90.91±1.10)%,NSC组:(77.10±0.56)%,P<0.05],而si/rSTIM1+hSTIM1组细胞STIM1 mRNA表达、钙离子浓度及分布在G1期的细胞数均恢复到NSC组水平.免疫共沉淀实验显示STIM1与TRPC1蛋白分子在EPC上相互作用,IP3浓度在三组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 STIM1基因沉默通过降低EPC的钙离子浓度,导致细胞周期停滞在G1期,调控EPC细胞增殖,TRPC1的钙库操纵性钙通道参与STIM1对EPC钙离子浓度的调节.

Abstract：

Objective To investigate the effect of stromal interaction molecule 1 (STIM1) silencing on EPCs cell cycle. Methods Rat bone marrow derived endothelial progenitor cells (EPCs) were isolated and cultured in L-DMEM with 20% FBS. Ad-si/rSTIM1 and Ad-hSTIM1 were then transfected into EPCs and the expression of STIM1 mRNA was detected by RT-PCR. The cell cycle was determined using flow cytometry analysis and intracellular free Ca2+ was measured using LSCM. Co-immunoprecipitation was performed to examine the interaction between STIM1 and TRPC1. Protein levels of inositol 1, 4, 5-trisphosphate were analyzed with ELISA assay. Results Forty-eight hours after transfection, the expression of STIM1 mRNA was significantly downregulated (0.37±0.02 vs.1.00±0.02, P<0.05) and intracellular free Ca2+ level was significantly reduced (34.07±4.10 vs. 86.51±14.12,P<0.05) in Ad-si/rSTIM1 group compared with control group. The cell cycle was arrested at G1 phase[(90.91±1.10)% vs. (77.10±0.56)%, P<0.05]and the store-operated channel entry was strikingly inhibited in EPCs after treatment with Ad-si/rSTIM1. However, cotransfection of Ad-hSTIM1 with Ad-si/rSTIM1 significantly reversed these responses. Interestingly, co-immunoprecipitation study showed that STIM1 co-precipitated with TRPC1, and IP3 levels measured by ELISA were similar among three groups (P>0.05). Conclusion siRNA-mediated knockdown of STIM1 inhibited EPCs proliferation by reducing intracellular free Ca2+ through TRPC1-SOC signaling pathway.     

脂蛋白相关性磷脂酶A2和巨噬细胞迁移抑制因子与易损斑块相关性的iMap-血管内超声研究

目的:通过iMap-血管内超声(iMap-IVUS)分析冠心病患者动脉粥样硬化斑块成分,探讨脂蛋白相关性磷脂酶A2(Lp-PLA2)及巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)水平与易损斑块间的关系。方法:连续选取冠心病患者74例,对其3支冠状动脉(冠脉)均进行IVUS检查,通过IVUS后处理软件测量患者冠脉管腔面积、斑块成分等相关指标,并根据患者病变性质将其分为斑块破裂组、易损斑块组和无易损斑块组,分析Lp-PLA2及MIF水平与患者易损斑块间的关系。结果:斑块破裂组较非斑块破裂组病变长度更长(P0.001),有更大的外弹力膜面积(P=0.014)和斑块面积(P=0.008),含有更多的脂质成分(P=0.009)和坏死核心(P0.001)。易损斑块组较无易损斑块组患者有更多的脂质成分(P0.05)和坏死核心(P0.001)。斑块破裂组Lp-PLA2水平明显高于非斑块破裂组(P=0.001),MIF水平差异无统计学意义;与无易损斑块组相比,易损斑块组Lp-PLA2水平显著升高(P=0.001),MIF水平未见统计学差异。Lp-PLA2与斑块易损性呈中等相关(r=0.448,P0.01),MIF与斑块易损性无明显相关性(r=0.121,P0.05)。结论:经iMAP-IVUS证实,Lp-PLA2能够反映斑块的易损性,MIF不能作为易损斑块的预测因子。     

同型半胱氨酸水平与冠状动脉斑块易损性相关性的研究

目的:探讨血浆同型半胱氨酸水平(HCY)与冠状动脉斑块易损性的相关性。方法:入选2015年1月至2015年12月,我科首次接受冠状动脉内药物洗脱支架置入术治疗的的冠心病患者78例,对病变部位进行血管内超声检查(IVUS),根据其特征分为易损斑块组(49例)及稳定型斑块组(29例)。比较两组患者的一般资料及HCY水平并对冠状动脉病变部位IVUS图像进行定量和定性分析。结果:与稳定斑块组相比,易损斑块组HCY水平显著增加(P0.01);其病变处血管面积(EEMA)、斑块面积(PA)、斑块负荷(PB)、偏心指数(EI)、正性重构及脂质斑块均显著增加(P0.05);负性重构更多见于稳定斑块组(P0.01)。HCY与EEMA、PA、PB、EI、正性重构及脂质斑块呈正相关(P0.05)。结论:高同型半胱氨酸水平增加冠心病患者病变血管斑块的不稳定性,联合IVUS检查有助于对冠状动脉易损斑块的判断。     

冠状动脉易损斑块及其形态学检测技术的新认识

冠心病患者发生严重急性冠状动脉事件约70%是由易损斑块(VP)所致。不稳定斑块的破裂是急性冠状动脉综合征(ACS)发生的核心机制,其较冠状动脉狭窄程度及病变范围更能反映冠心病患者发生急性心血管事件。现代影像学技术的进展,特别是血管内超声(IVUS)及光学相干断层成像(OCT)对识别和判断VP的形态学特征,包括斑块的形态、成分,甚至功能状态提供了快速、可靠的信息支持,在诊断和评价冠状动脉斑块方面,高分辨率的0CT检测水平已近似于组织学检测水平。该文就VP形态学检测技术的进展和认识作一简要综述。