人食管癌顺铂耐药细胞系的建立及耐药相关基因的筛选

目的:建立人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,并初步探讨其耐药机制。方法:采用顺铂(cDDP)中等浓度、间歇冲击作用方法历时9mon诱导人食管癌细胞系Ec9706,建立相应耐药细胞系,采用MTT法测定耐药细胞系对cD-DP的耐药指数,用RT-PCR半定量方法测定亲本细胞及耐药细胞耐药相关基因如DNA聚合酶(polβ)、多药耐药相关基因(MRP)、谷胱甘肽转移酶(GST)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、拓扑异构酶(TPO)和多药耐药基因(mdr1)等基因的mRNA表达水平。结果:人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP的耐药指数为15.7,该细胞系中polβ、DHFR、GST基因mRNA的表达比亲本细胞显著增加,TPO的表达降低,而mdr1、MRP表达的增加无显著统计学意义。结论:成功建立了人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,其耐药性的产生与polβ、GST、DHFR、TPO等基因的异常表达有关,而与mdr1、MRP表达的关系不密切。     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

参苓白术散含药血清影响A549/DDP的顺铂耐药的研究

目的:研究参苓白术散含药血清对肺腺癌顺铂细胞株(A549/DDP)顺铂耐药的影响.方法:动物随机分组,制备参苓白术散大中小剂量血清(给药剂量分别为11.34,5.67,2.83g·kg-1·d-1),将A549,A549/DDP细胞体外分为顺铂(DDP)组,空白血清+DDP组,含药血清大剂量+DDP组,含药血清中剂量+DDP组,含药血清小剂量+DDP组,细胞对照组,经过15%各组血清联合DDP不同浓度(10,20,40,80,100,200μmol·L-1)作用48 h,采用MTT法检测参苓白术散不同浓度含药血清对A549/DDP顺铂耐药的作用;结果:与DDP组比较,参苓白术散不同浓度含药血清作用于A549/DDP后IC50和耐药倍数均有显著降低(P<0.05),以中剂量组(等临床剂量组)作用最为显著(P<0.01).结论:参苓白术散能增强A549/DDP对顺铂的敏感性.     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

人参皂苷Rg3对人肺腺癌细胞株A549/DDP抑制转移及逆转耐药作用的研究

目的:探讨人参皂苷Rg3抑制人肺腺癌细胞株A549/DDP的浸润及转移和逆转其耐药作用及机制。方法:应用MTT法检测Rg3对A549/DDP细胞逆转耐药的作用;用细胞膜流动性实验检测Rg3对A549/DDP细胞膜流动性的改变用穿膜实验检测Rg3对A549/DDP细胞侵袭和转移的影响;用Western blotting实验检测Rg3对转移和耐药相关蛋白表达的影响。结果:Rg3作用后,A549/DDP细胞对顺铂的耐药性下降I,C50明显降低(P<0.05),细胞膜的流动性明显降低(P<0.05),细胞的穿膜能力明显降低(P<0.05),Rg3作用后,nm23及caspase-3的表达明显上调,LRP的表达无明显改变。结论:Rg3可通过上调nm23的表达抑制A549/DDP细胞的侵袭和转移能力,还可通过上调caspas-3的表达,降低细胞膜的流动性达到逆转耐药的作用。     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

Twist1基因在A549与A549/DDP细胞中的表达及意义

  目的  探讨细颗粒物（PM_2.5）暴露对大鼠肺组织及H1299细胞中Zeb1、Twist1的表达和细胞增殖影响。  方法  体内实验：40只大鼠分别给予PM_2.5混悬液和生理盐水,于暴露后2和4周收集肺组织;体外实验：分别用0、50、100、200 μg/mL PM_2.5混悬液培养H1299细胞48 h,收集细胞;采用免疫印迹法法检测小鼠肺组织和H1299细胞中Zeb1、Twist1蛋白表达,采用噻唑蓝（MTT）法检测H1299细胞增殖率。  结果  体内实验：与对照组[（0.68 ± 0.19）、（0.99 ± 0.11）]比较,PM_2.5暴露大鼠4周后肺组织中Zeb1、Twist1蛋白表达量[分别为（0.27 ± 0.18）（0.44 ± 0.15）]明显下调（P < 0.05）。体外实验：与对照组[（1.34 ± 0.38）、(1.05 ± 0.11）]比较,200 μg/mL PM_2.5染毒组H1299细胞中Zeb1、Twist1蛋白表达量[分别为（0.17 ± 0.08）、（0.20 ± 0.05）]明显下调（P < 0.05）;200 μg/mL PM_2.5处理H1299细胞72 h,H1299细胞生存率为（25.26 ± 1.84）%,明显低于对照组（P < 0.05）。  结论  PM_2.5暴露后,小鼠肺组织及人肺腺癌细胞H1299中Zeb1、Twist1表达明显降低,并且肺癌细胞（H1299）呈现增殖抑制现象。     

重组CKB真核表达载体的构建及其稳定转染NCI—H520细胞系的建立

目的构建pEGFP—N1－CKB真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞NCI—H520中,建立稳定转染的NCI—H520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以人CKBcDNA文库为模板,用PCR扩增人CKBcDNA的编码区,并将扩增的cDNA片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系NCI—H520,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用Westernblot检测转染前后该细胞株CKB基因的表达。结果pEGFP—N1－CKB经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经Westernblot检测,重组质粒转染株中CKB基因的表达水平明显高于对照组,证实CKB基因已稳定转染到NCI-H520细胞中并得到表达。结论成功构建了pEGFP—N1－CKB真核表达质粒,建立了稳定表达CKB的NCI-H520细胞系,为进一步研究CKB的生物学功能奠定了基础。     

ATRN基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定针对基因ATRN的特异性siRNA真核表达载体。方法:根据ATRN基因cDNA序列,设计针对目的基因ATRNcDNA序列的3个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论:本研究成功构建针对ATRN的特异性真核表达载体,为进一步研究ATRN基因在雄性生殖系统的功能奠定基础。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据.方法 提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定.结果 扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL.     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

沙利度胺联合顺铂对A549肺腺癌细胞株的体外实验

目的观察沙利度胺与顺铂（DDP）联合应用对A549人肺腺癌细胞凋亡的影响,观察沙利度胺对肺腺癌A549细胞VEGF、BFGF蛋白表达的影响。方法采用PI单染法流式细胞检测细胞凋亡率;采用免疫细胞化学方法检测沙利度胺处理后肺腺癌A549细胞VEGF、BFGF蛋白表达的变化。结果在一定浓度范围内,沙利度胺联合DDP处理组细胞凋亡率明显高于单药组;沙利度胺（7.5mg/L）作用于人肺腺癌A549细胞后,处理组的VEGF、BFGF蛋白表达与未加药组比较差异显著。结论沙利度胺DDP联合,可增加A549人肺腺癌细胞的凋亡率;沙利度胺可抑制A549人肺腺癌细胞VEGF、BFGF的蛋白表达。     

结核杆菌MTC28基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]对结核杆菌MTC28基因进行克隆,构建真核表达质粒并加以鉴定.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增带信号肽MTC28目的基因,经NheI和EcoRI消化后,与PCDNA3.1(+)载体进行连接重组.[结果]PCDNA3.1(+)-MTC28真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.[结论]PCDNA3.1(+)-MTC28真核表达质粒的成功构建,为进一步研究该质粒的免疫保护效果,了解信号肽序列在MTC28蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础.     

重组人缺氧诱导因子-1α基因真核表达载体的构建及表达

目的构建重组人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)真核基因表达载体pSNAV-HIF-1α并观察其在原代培养海马神经细胞中的表达。方法采用基因重组技术,将pBSKhHIF 1αT7原核表达载体上HIF-1α基因序列克隆至真核表达载体pSNAV2.0,磷酸钙共沉淀法介导转染pSNAV-HIF-1α,采用Western blot检测HIF-1α蛋白。结果酶切、PCR及DNA测序结果均表明成功构建了重组质粒pSNAV-HIF-1α,磷酸钙共沉淀法介导的pSNAV-HIF-1α质粒转染显著增加了海马神经细胞HIF-1α蛋白表达(P0.05)。结论成功构建了pSNAV-HIF-1α,为进一步应用该基因进行临床基因治疗提供了实验依据。     

甲羟孕酮对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP耐药的逆转作用

目的:应用甲羟孕酮(Medroxyprogesterone Acetate,MPA)体外逆转人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的耐顺铂(cisplatin,DDP)效应,并对其作用机制进行初步探讨。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测MPA对SKOV3/DDP的细胞毒作用,确定MPA对此细胞株的非细胞毒性剂量作为逆转剂量,同法测定非细胞毒性剂量MPA联合DDP作用后SKOV3/DDP对顺铂耐药性的变化,采用流式细胞技术(FCM)检测细胞周期及凋亡情况。结果:单用MPA浓度大于7.50 g/L时对SKOV3/DDP细胞有不同程度的抑制作用,且呈剂量依赖性。MPA浓度小于15.85 g/L时,其对细胞生长无明显抑制作用(细胞存活率均>90%),因此选用15.00 g/L作为逆转剂量。DDP联合15.00 g/L的MPA作用24、48、72 h后,顺铂的IC50分别下降至(57.72±0.48)g/L、(13.39±0.21)g/L、(7.93±0.18)g/L,逆转倍数分别为1.22,1.90,2.44倍。DDP与MPA联合作用于SKOV3/DDP细胞,使其细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞比例下降,并可以增加耐药细胞的凋亡率。结论:MPA可以逆转DDP引发的卵巢癌耐药,其可能的逆转耐药机制为促进细胞的凋亡,阻滞细胞周期进程。     

肺腺癌组织Nrf2和xCT蛋白表达及与顺铂耐药相关性分析

目的 分析肺腺癌组织中NF-E2相关因子(Nrf2)、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(xCT)蛋白表达水平与顺铂(DDP)耐药性的相关性.方法 选取济南市第七人民医院2015-10-01-2018-10-01收治行外科根治手术切除的76例肺腺癌患者为研究对象,并在术后接受2～4次以铂类为主的化疗,分析...     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

HPV18-L1基因真核表达载体的构建及其表达

目的:从人乳头瘤病毒(HPV)阳性的宫颈癌组织中克隆HPV18型主要衣壳蛋白L1基因全长,构建真核表达载体及验证目的蛋白的表达。方法:根据HPV18-L1基因全长设计一对特异引物,用PCR方法从宫颈癌组织DNA中获得L1基因,构建pMD18T重组质粒扩增L1基因,以pVAX1为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入地鼠肾细胞BHK,采用免疫细胞化学方法检测HPV18-L1蛋白的表达。结果:从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV18-L1基因序列与Genebank报道序列高度同源,其真核表达产物能够与特异性抗体发生特异性结合。结论:成功构建pVAX1-HPV18-L1重组真核表达质粒,为研制地区特异性HPV预防性疫苗提供基础实验参考。     

结核分枝杆菌PE35基因真核表达载体的构建及其表达

目的获得带FLAG标签的结核分枝杆菌PE35的真核表达载体,并在293T细胞中检测其表达。方法用PCR方法从质粒上获得PE35基因全长,克隆到pCDNA3-FLAG真核表达载体上;用脂质体介导的基因瞬时转染法,将构建正确的表达载体转染293T细胞;Western-blot法检测细胞中的FLAG融合蛋白的表达。结果酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的FLAG-PE35真核表达载体,并能在真核细胞中表达相对分子量大小相符的重组蛋白。结论成功构建了FLAG-PE35真核表达载体,并在真核细胞中得到表达。为研究PE35蛋白在结核分枝杆菌中的功能研究奠定了基础。