EMA-PCR方法检测饮用水中3种食源性致病菌活菌研究

摘要:目的　将EMA（Ethidium Monoazide Bromide）选择渗透性与PCR技术相结合,建立有效快速检测饮用水中3种食源性致病菌活菌EMA-PCR方法。方法　以鼠伤寒沙门菌invA、肠出血性大肠杆菌O157:H7 rfbE、铜绿假单胞菌oprI基因为PCR检测靶基因,纯培养物提取模板进行PCR,进行EMA使用浓度及灵敏度试验。结果　EMA浓度不大于10 μg/ml对活菌DNA扩增没有明显抑制,终浓度为1 μg/ml EMA能有效抑制死菌扩增;对鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、铜绿假单胞菌的EMA-PCR灵敏度分别为1.2×104 CFU/ml、2×105 CFU/ml、3×104 CFU/ml;用10 μg/ml EMA处理饮用水水样,可同时检测出饮用水中含有的3种食源性致病菌活菌。结论　EMA-PCR方法可一次检测饮用水中3种食源性致病菌活菌,能避免PCR检测可能造成假阳性结果。     

EMA-RTQ-PCR快速鉴别沙门菌死活细胞方法的建立

摘要:目的　利用EMA（Ethidium Monoazide）能选择性与死细胞DNA非可逆共价结合的特性,建立EMA-RTQ-PCR方法快速鉴别沙门菌死活细胞。方法　选择300 μl、3.3×108 CFU/ml沙门菌灭活条件;检测RTQ-PCR的灵敏度与特异性;选择能抑制3.3×108 CFU/ml死细胞DNA扩增的EMA浓度,观察该浓度EMA对活菌扩增的影响。结果　灭活条件为65℃、10 min;RTQ-PCR检测沙门菌的灵敏度为25 CFU,特异性好;30 μg/ml的EMA可抑制3.3×108 CFU沙门菌死细胞DNA的扩增;30 μg/ml的EMA对活菌扩增的影响可通过离心消除;活菌数/死菌数≥40%时,可以检出活菌;当活菌数量足够大时,死菌的存在不影响实验结果。结论　本研究建立的快速鉴别沙门菌死活细胞EMA-RTQ-PCR方法可行,能有效避免单纯PCR检测沙门菌产生的假阳性结果。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。     

改良RNA提取法应用于RT-PCR检测O157︰H7活菌

目的将改良的RNA提取法应用于RT-PCR,建立一种快速灵敏检测肠出血性大肠杆菌O157:H7活菌的方法。方法以O157︰H7 rfbE基因为靶基因设计引物,样品中加入较大浓度的非目标菌后,用TRIzol试剂提取细菌总RNA后,gDNA Eraser去除其中污染的DNA,通过RT-PCR检测O157︰H7 rfbE的mRNA。结果 RT-PCR法能有效检测样品中的O157︰H7活菌,死菌不被检测。未加入非目标菌(志贺菌)检测O157︰H7检出限为3.4×108cfu/ml,加入非目标菌共沉淀提取RNA,检出限下降至3.4×105cfu/ml,检测灵敏度提高了1 000倍。结论改良RNA提取法应用于RT-PCR能够快速灵敏检测O157︰H7活菌,在突发公共卫生事件的应急处理方面有良好的应用前景。     

EMA-PCR技术检测金黄色葡萄球菌活菌

目的将叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)与聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相结合,建立一种快速、有效检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。方法用EMA处理金葡菌培养物后提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因(nuc基因)为靶基因进行PCR反应,并对EMA浓度和曝光时间等条件进行优化。结果当检测2×106CFU/ml的金黄色葡萄球菌时,能有效抑制死菌DNA扩增的EMA最小浓度为0.3μg/ml,对活菌DNA扩增没有明显抑制的EMA最大浓度为2μg/ml;经EMA处理后,从含有1%金黄色葡萄球菌活菌混合悬液制备的DNA中可扩增出目的片段。结论 EMA-PCR能有效检测金黄色葡萄球菌活菌,在临床医学和公共卫生领域检测中具有重要的实用价值。     

鉴定大肠杆菌O157:H7特异基因的PCR方法

目的建立一种特异、灵敏鉴定大肠杆菌O157:H7的PCR检测方法。方法针对大肠杆菌O157:H7表面抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbO157、fliCH7设计引物,分别扩增出目的产物。结果利用建立的方法对4株大肠杆菌O157:H7菌及12株非大肠杆菌O157进行检测,rfbO157、fliCH7基因的特异性均为100%;rfbO157基因的灵敏度约为6×104cfu/ml;fliCH7基因的灵敏度可达6cfu/ml。结论本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌O157:H7提供了一种简单、容易操作的手段。     

大肠埃希菌O157:H7的实时荧光PCR检测方法研究

目的建立一种敏感、特异、快速的大肠埃希菌O157:H7的检测方法,应用于突发公共卫生事件及食源性致病菌流行病学调查的检测。方法根据GenBank大肠埃希菌O157:H7rfbE基因序列,设计引物和TaqMan探针,对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立实时荧光PCR检测大肠埃希菌O157:H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果大肠埃希菌O157:H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1×102cfu/ml。模拟污染的猪肉、羊肉、鸡肉、生食蔬菜样品,均可检出1×104cfu/ml的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3 h。结论建立的实时荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点,可用于大肠埃希菌O157:H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响.方法选择O157∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测40株O157∶H7和非O157∶H7菌株,将细菌按10+1～10+6稀释后比较PCR的检测灵敏度.结果所有O157∶H7菌株均在497 bp和625 bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484 bp和(或)210 bp处出现SLT2和(或)SLT1基因产物,非O157∶H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测灵敏度为150 CFU/PCR反应,多重PCR为＞1 500 CFU/PCR反应.结论在经过增菌后,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为产毒和非产毒O157∶H7的诊断提供了新的手段.     

解旋酶依赖性等温扩增快速检测O157:H7及其毒力基因的研究

目的建立一种快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的解旋酶依赖性等温扩增法(HDA)。方法以大肠杆菌O157:H7的溶血素基因(hly)、粘附抹平因子(eae)和O抗原编码基因(rfb)为扩增对象,设计3对特异性HDA引物,通过优化条件后进行灵敏度和特异度试验,并与普通PCR法比较。结果 HDA法从标准菌株和实验室分离株中均扩增出hlyA、eaeA和rfb基因片段,产物大小分别为100、93和109 bp,而其他非大肠杆菌O157:H7的扩增结果均为阴性。通过对各梯度大肠杆菌O157:H7菌悬液的检测表明HDA法可以检测的最低菌液浓度为3.0×101cfu/ml,该法与普通PCR法灵敏度相当。结论本HDA法具有较高的灵敏度和特异度,可快速、高效地检出大肠杆菌O157:H7菌和其毒力基因,而且对试验仪器要求低,特别适合应急处置现场和基层检验机构作为临床大肠杆菌O157:H7感染的辅助诊断。     

复合探针实时荧光PCR检测大肠杆菌O157:H7

目的建立一种快速、准确、特异的肠出血性大肠杆菌O157:H7的定量检测方法。方法以rfbE基因作为待检靶基因,根据复合探针荧光定量分析原理设计检测引物和探针,建立检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量PCR方法。并对本方法检测的特异性、灵敏度、重复性等进行评价。结果所有O157:H7的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达10 cfu.mL-1,定量检测的批间和批内差异均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×101cfu.μL-1的细菌。结论本文建立的复合探针实时荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地对大肠杆菌O157:H7进行定量分析,为大肠杆菌O157:H7的检测提供了新的方法。     

PCR检测肠出血性大肠杆菌O157：H7

目的：研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157：H7的多重PCR方法，并比较第一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响。方法：选择O157：H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物，分别或共同进行PCR扩增，检测40株O157：H7和非O157：H7菌株，将细菌按10^1-10^6稀释后比较PCR的检测灵敏度。结果：所有O157：H7菌株均在497bp和625bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物，其产毒株在484bp和（或）210bp处出现SLT2和（或）SLT1基因产物，非O157：H7菌株PCR结果均为阴性；单一PCR检测灵敏度为150CFU／PCR反应，多重PCR为＞1500CFU／PCR反应。结论：在经过增菌后，多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便，为产毒和非产毒O157：H7的诊断提供了新的手段。     

动物性食品中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

目的:大肠杆菌O157:H7是近年来引发食物中毒事件的重要病原菌,对其建立灵敏、特异的多重PCR检测方法,是确保饮食安全,预防和控制大肠杆菌O157:H7传播的重要手段。方法:根据大肠杆菌O157:H7rfbE和fliC抗原基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为678 bp(rfbE)和560 bp(fliC)。结果:建立的多重PCR方法可以快速特异地检测出猪肉、牛肉等动物性食品中的大肠杆菌O157:H7污染,人工污染猪肉检测限达到2.2×102cfu/ml。结论:选择两对特异引物的多重PCR方法可简便、快速、特异地实现对动物性食品中大肠杆菌O157:H7的检测。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7多重PCR快速检测研究

[目的]建立能快速、特异检测肠出血性大肠杆菌O157︰H7的多重PCR技术。[方法]选用针对大肠杆菌O157志贺样毒素1、2(slt1/slt2)基因、溶血素(hlyA)基因、和O157特异性基因(rfbE)的4对引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了猪肉模拟样品检测。[结果]该方法扩增目的基因片段分别为348,584,250bp和497bp,特异性和灵敏度均高。细菌纯培养物的检测灵敏度为103cfu/ml,猪肉模拟样品37℃预增菌4h后检测灵敏度能达到100cfu/ml。[结论]初步建立了快速、灵敏、特异地测定肠出血性大肠杆菌EHECO157︰H7的多重PCR检测技术。     

改良分子信标-实时PCR快速检测4种食源性致病菌

目的建立高效、特异、简便、快速的四重实时荧光PCR(real-time PCR)检测体系同时检测沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7 4种常见的主要食源性致病菌。方法从Gen Bank数据库中下载沙门菌侵袭性基因ssaR、金黄色葡萄球菌肠毒素nuc基因、单增李斯特菌的hly A基因、大肠杆菌O157:H7的rfb E基因序列,设计引物和探针,利用HAND系统和多色探针编码技术,通过对PCR反应的组分和条件进行优化,建立针对肉类食品中4种食源性致病菌四重实时荧光PCR体系。结果成功建立了检测肉类食品中4种食源性致病菌四重实时荧光体系,DNA和细菌纯培养的最低检测限达到1~100 fg/PCR和1~6.25 CFU/PCR,特异性均达98%以上。结论本文利用HAND系统和多色探针编码技术相结合,构建了针对4种食源性致病菌四重实时荧光PCR体系。可用于食品中食源性致病菌的快速筛查和食源性疾病暴发的快速诊断。     

环境水体中痢疾志贺菌荧光定量PCR检测方法研究

目的对环境水体中痢疾志贺菌荧光定量PCR检测方法进行研究和评价。方法根据痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H(invasion plasmid antigen H,ipa H)基因设计引物,利用普通PCR方法扩增其ipa H基因并将其与T载体进行连接以获得ipa H-T重组质粒;对重组质粒进行梯度稀释后进行荧光定量PCR,观察其标准曲线及最低检出限;提取17株可在环境水样中存在的多种致病菌DNA并以同样反应体系进行荧光定量PCR,验证该方法的特异性;将痢疾志贺菌加标于地表水水样中,测试该方法的环境样品检测能力。结果成功扩增痢疾志贺菌ipa H基因并连接T载体;通过荧光定量PCR检测各梯度浓度重组质粒的Ct值间隔相近,检出限低至10 copies;17株致病菌DNA的检测结果均为阴性,显示该方特异性好;在环境地表水菌落总数为3.5×103 CFU/ml、痢疾志贺菌加标浓度低至5 CFU/ml时,仍可以通过该方法检出,显示该方法的抗干扰能力强,可用于环境水样的直接检测。结论通过荧光定量PCR方法可实现对水中痢疾志贺菌进行快速检测,检测时限3 h以内,检测浓度5 CFU/ml,特异性及抗干扰性好,可用于污染水样的快速直接检测。     

沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR快速检测体系的初步探讨

目的建立能在12小时内同时快速检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR体系。方法碱性蛋白胨水（BPW）非选择性增菌6h；100℃10min制备DNA模板；根据大肠杆菌O157：H7的uidA基因、志贺菌的ipaH基因及沙门菌的invA基因序列设计各菌引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定体系灵敏度和特异性。结果该多重PCR体系能在12h内同时检测3种目的菌；灵敏度为10～30cfu／ml；通过对23株目的菌和15株非目的菌检测，提示该体系特异性高。结论初步探讨出能在12h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR体系。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌的多重PCR检测

目的 建立同时检测肠出血性大肠杆菌(O157：H7)和霍乱弧菌的多重PCR方法,为霍乱和肠出血性大肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。方法 首先选择O157：H7的O抗原(rfbE)、H鞭毛抗原(fliC)基因以及霍乱孤菌外膜蛋白(ompW)和肠毒素A亚单位(ctxA)基因特异的4对引物,分别或共同对O157：H7和霍乱孤菌进行PCR扩增,并以琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果 所有O157：H7菌株均在497bp和625bp处出现O157 rfbE基因和H7 fliC基因扩增产物;霍乱菌株均出现560bp、302bp的ompW和ctxA基因扩增产物,O157：H7和霍乱弧菌共同扩增可出现4条单一条带。结论 选择4对特异引物的多重PCR方法可简便、特异、快速、灵敏地对O157：H7和霍乱弧菌进行同时检测。     

常见7种食源性致病菌xMAP液相芯片快速筛查方法的建立及应用

目的采用xMAP液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测金黄色葡萄球菌、沙门菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、创伤弧菌和空肠弯曲菌的快速筛查方法。方法根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素nuc基因、沙门菌侵袭性基因ssaR、副溶血弧菌通用基因toxR、单增李斯特菌的hlyA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因、创伤弧菌的vvh基因和空肠弯曲菌的gyrA基因,设计特异性引物和探针,利用上游引物和生物素标记的下游引物对7个靶序列进行不对称实时PCR扩增,7重实时PCR扩增产物和制备的7种偶联探针的微球在同一体系中进行杂交,最后利用藻红蛋白和生物素的亲和作用报告荧光,从而建立7种食源性致病菌的xMAP液相悬浮芯片检测法。结果 xMAP液相悬浮芯片体系检测140株菌株,均出现特异性荧光中值信号,7种食源性致病菌检测互不干扰。DNA和菌液检出限分别为1～100ng和105～108cfu/ml对56份各类食品标本进行检测,检出金黄色葡萄球菌2份、沙门菌4份、副溶血弧菌7份、单增李斯特菌1份、创伤弧菌3份,未检出大肠杆菌O157∶H7和空肠弯曲菌,此结果与传统方法分离结果相一致。结论xMAP液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右,该方法可应用于食品安全风险监测中食源性致病菌的快速筛查和食源性致病菌的分型鉴定。     

沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR快速检测体系的初步探讨

目的建立能在12小时内同时快速检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系。方法碱性蛋白胨水(BPW)非选择性增菌6h;100℃10min制备DNA模板;根据大肠杆菌O157∶H7的uidA基因、志贺菌的ipaH基因及沙门菌的invA基因序列设计各菌引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定体系灵敏度和特异性。结果该多重PCR体系能在12h内同时检测3种目的菌;灵敏度为10～30cfuml;通过对23株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步探讨出能在12h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系。     

ELISA与免疫传感器在大肠杆菌内毒素检测中的应用

目的:研究两种基于免疫反应和电化学的简便、灵敏、特异检测内毒素的新方法。方法:应用ELISA建立PMB-ET-ELISA法和免疫传感器法对大肠杆菌内毒素进行分析,并对两种方法检测范围和最低检测限进行分析和比较。结果:ELISA方法检测精制内毒素范围为1μg/ml～1 mg/ml,检测大肠杆菌O157:H7范围为105 CFU/ml～109 CFU/ml,相当于内毒素190μg/ml～2918μg/ml。免疫生物传感器法检测精制内毒素范围为1μg/ml～1 mg/ml;检测大肠杆菌O157:H7范围为106 CFU/ml～109 CFU/ml,相当于内毒素288μg/ml～1416μg/ml。结论:建立的ELISA和免疫传感器两种检测内毒素新方法有效、稳定、可用。