多种单抗联合检测HIV抗原

目的 建立多种单抗联合早期检测HIV抗原的夹心ELISA方法.方法 以SAS盐析沉淀法和亲和层析法纯化抗HIV-1 p24、gp41、gp120及抗HIV-2 gp36的腹水型单克隆抗体(McAb),用高碘酸钠法将纯化的McAb以HRP进行标记.建立针对单个抗原的双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测.将筛选得到的4株捕获McAb按比例混合作为捕获抗体,4株酶标McAb按比例混合作为检测抗体,建立多种单抗联合检测HIV抗原的夹心ELISA方法,检测混合HIV抗原.结果 按确定的最优反应条件建立的多种McAb联合夹心ELISA方法,检测到的最高稀释度的HIV混合抗原中各抗原的终浓度分别为:重组HIV-1 p24:0.625 pg/ml,gp41:6.25 ng/ml,gp120:6.25 ng/ml;HIV-2 gp36:9.25 ng/ml.结论 建立了具有高度敏感性的鸡尾酒式多种单抗联合检测HIV抗原的夹心ELISA法,为早期榆测HIV抗原提供了新的思路,为后续的研究奠定了一定基础.     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及其初步应用

目的：制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体（mAb），并建立一种可用于检测gp120的ELISA法。方法：采用基因工程抗原HIV-1gp120免疫BALB／c小鼠，通过B细胞杂交瘤技术制备抗HIV-1gp120的mAb。用ELISA法答定mAb的Ig亚类、效价及特异性。用饱和硫酸铵（SAS）纯化mAb，并用HRP标记后建立双mAb夹心ELISA法。结果：筛选出10株稳定分泌抗HIV-1gp120 mAb的杂交瘤细胞株，9株为IgG，其中4株的腹水效价为32X10～256X10所得mAb与HIV-1gp41、HIV-1p24及HIV一2gp36Ag均无交义反应，仅与HIV-1gp120产生特异性反应。用mAb 6H9和9H12，建立了双夹心ELISA法，检测gp120抗原的灵敏度是10μg／L。结论：获得10株特异性强、效价高的机HIV-1gp120的mAb，并建立了灵敏度良好的双mAb夹心ELISA法.     

抗HIV-1 p24 单克隆抗体的制备、特性鉴定及初步应用

目的：制备抗HIV-1p24单克隆抗体（mAb）及特性鉴定。方法：采用细胞融合技术制备可稳定分泌抗HIV-1p24mAb的杂交瘤细胞。选择高效价、识别不同抗原表位的mAb纯化后，分别包被ELISA板及作为酶标记mAb，建立双mAb夹心ELISA法，检测400份正常人血浆，20份抗HIV抗体阳性（p24抗原阴性）的血浆，20份HIV-1感染的细胞培养上清及HIV-1p24抗原国家参考品，并同时用进口p24抗原检测试剂盒进行对比检测。结果：经细胞融合、筛选、克隆化，共获得10株可分泌高效价mAb的杂交瘤细胞。纯化的腹水mAb经配对试验，选A值≥2．50的2株mAb建立的双mAb夹心ELISA法，敏感性可达2．5ng／L，且与进口试剂盒检测结果的一致性良好。结论：建立了具有高度敏感性和特异性的双mAb夹心ELISA法，为研制可用于检测HIV-1p24抗原的试剂盒奠定了基础。     

抗原捕获ELISA检测卡波济肉瘤相关疱疹病毒的方法建立

目的 建立检测卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的抗原捕获ELISA方法,初步探讨其临床应用的可行性. 方法 以纯化的抗gpK8.1单克隆抗体(McAb)和多克隆抗体(PcAb)配对作为包被抗体和检测抗体,建立和优化抗原捕获ELISA检测方法,评价其敏感性、特异性和重复性,并初步用于3例已知KSHV阳性血清和257例临床血清样品中抗原的检测. 结果 包被的McAb浓度为5μg/ml、检测抗体浓度为1.6 μg/ml时,P/N值最高,检测的敏感度为31.28 ng/ml,且与EB病毒(ESV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)等抗原无交叉反应,特异性高.检测3例KSHV阳性患者血清均为阳性,在257例临床血清样品中,4例捕获到KSHV抗原. 结论 建立了检测KSHV的抗原捕获ELISA方法,为可能的KSHV检测试剂研制提供重要实验依据.     

抗烟曲霉菌单克隆抗体鉴定和初步应用

目的 :制备抗烟曲霉菌单克隆抗体 (McAb) ,建立一种快速检测烟曲霉菌抗原方法。方法 :用基因重组烟曲霉菌半乳糖甘蛋白 (AFMP1)抗原 ,免疫BALB/c小鼠 ,制备单克隆抗体 ,选择针对不同抗原决定簇单抗配对 ,建立双抗夹心ELISA法检测烟曲霉菌抗原。结果 :筛选出 3株稳定分泌抗烟曲霉菌单抗杂交瘤细胞株 ,IgG亚类鉴定分别为IgG1、IgG2a、IgG2b ,抗体亲和常数分别为 1 2× 10 10 、4 5 6× 10 9和 1 81× 10 10 mol/L ,免疫印迹证实单抗特异性识别烟曲霉菌培养上清和细胞裂解产物 ,相加试验表明 3株单抗是针对不同抗原决定簇 ,组成配对双抗夹心ELISA法 ,检测最高灵敏度为 0 1ng/ml,可测范围为 0 1～ 6 0ng/ml。结论 :3株杂交瘤细胞株特异性好、亲和力高 ,组成配对夹心ELISA法可用于快速检测烟曲霉菌抗原。     

抗HPT单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定

目的：制备抗潮霉素B磷酸转移酶(HPT)的单克隆抗体(McAb)，建立一种快速检测转基因作物中该选择标记基因HPT编码蛋白的方法。方法：用基因重组潮霉素B磷酸转移酶(HPT)抗原免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb。选择不同的抗原决定簇与兔抗HPT多抗配对，建立双抗夹心ELISA检测HPT抗原。结果：筛选出四株稳定分泌抗HPT单抗的杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定均为IgG1，ELISA检测证实单抗可特异性识别细胞培养上清、重组子菌体裂解产物中及纯化出的HPT蛋白。结合位点测定实验表明4株单抗是针对不同的抗原决定簇，与多克隆抗体组成双抗夹心ELISA法，均可较好地检测到HPT抗原。检测的灵敏度为30ng／ml，且与别的无关抗原无交叉反应性。结论：4株杂交瘤细胞株特异性好，亲和力强，组成双抗夹心ELISA法可用于快速、灵敏检测HPT抗原。     

同时检测HIV抗体及p24抗原快速诊断试剂的研制

目的：研制可同时检测HIV－1、HIV－2抗体及p24抗原的胶体金快速诊断试剂。方法：利用重组杆状病毒－昆虫细胞系统进行HIV－1 gp41及HIV－2 gp36抗原的高效表达，以免疫亲和层析法纯化抗原。抗－HIV p24单克隆抗体杂交瘤细胞株，并制备抗－HIV p24单克隆抗体。以硝酸基纤维膜为载体，以纯化的HIV－1 gp41、HIV－2 gp36抗原及抗p24抗体点膜，20nm胶体金颗粒／抗人IgG和抗－HIV p24单克隆抗体进行标记，对33份已知HIV感染者阳性血清及6份阴性血清进行检测。结果：通过重组杆状病毒－昆虫细胞系统进行HIV－1 gp41及HIV－2 gp36抗原的表达，可获取浓度为2．0mg/L的纯化抗原。从抗p24单克隆抗体杂交瘤细胞株中培养上清液，通过葡萄球菌蛋白A免疫亲和层析柱可得到1．5mg/L的纯化抗体。利用纯化的抗原抗体进行标记，对39份已知血清进行检测，与荷兰Organon公司HIV1＋2抗体、p24抗原、ELISA诊断试剂同时检测结果进行比较，证实有较强的特异性及敏感性。结论：同时检测HIV－1、HIV－2抗体及p24抗原快速诊断试剂的问世，可为HIV感染的诊断提供一个简便、可靠、敏感的方法。     

高效表达重组HIV-1 gp41及在尿液检测中的应用

目的 应用优化的HIV-1 gp41基因,通过原核表达得到高纯度的重组HIV-1 gp41抗原,制备基于重组gp41抗原的尿液HIV-1抗体检测试剂盒,并评价此试剂盒在尿液抗体检测中的灵敏度和特异性.方法 将编码HIV-1B亚型gp41主要抗原表位的基因插入到原核表达载体pET22b中,构建表达质粒pET22b-mgp41.将表达质粒转化B121(DE3)后经IPTG诱导其表达重组抗原rgp41.重组抗原经镍离子亲和层析和分子筛层析得到纯化.将纯化后重组抗原包被ELISA板,对4796份正常人群尿液、641份HIV-1抗体阳件感染者尿液进行HIV-1抗体检测.结果重组抗原经纯化后纯度95%.用本实验中制备的HIV-1抗体尿液检测试剂盒的检测结果显示,此试剂盒灵敏度为100%,特异性为98.52%.结论 本研究中制备的HIV-1尿液诊断试剂盒可以满足HIV感染者初筛实验的需要.     

甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1和A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.     

甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1和A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.     

双抗原夹心法检测抗HIV-1/2总抗体方法的建立和评价

目的 进一步提高HIv感染诊断试剂的敏感性。方法 以人工合成的HIv—1 gp41．1(sP1)、gp41．2(sP2)、gp120(sP3)、P24(sP4)和HIV—2gp36(sP5)5条多肽，采用双抗原夹心酶链免疫吸附试验(ELISA)原理，以sP1、sP3、sP4和sP5混合包被酶标板作为因相抗原，辣根过氧化物酶标记sp1、sp2、sP4和sP5多肽为标记物，建立了检测抗HIV—1／2总抗体的双抗原夹心ELISA法。结果 检测卫生部药品生物制品检定所第2代40份质控参比血清，其特异性和灵敏度均为100％，高于间接ELISA法(特异性为90％，灵敏度为65％)。检测210份其他病种患者血清均为阴性，与雅培HIVAB试剂比较检测如份健康献血员血清和88份HIv感染者血清，符合率为100％。结论 本方法特异性强、敏感性高，操作简便，适用于献血员的筛选和临床HIv感染的检测。     

A novel enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to HIV-1 envelope glycoproteins based on immobilization of viral glycoproteins in microtiter wells coated with concanavalin A

We have developed a novel method that greatly simplifies the preparation of solid-phase HIV-1 envelope glycoproteins for use in an ELISA that detects serum antibodies to HIV envelope antigens. This method utilizes concanavalin A absorbed to wells of microtiter plates to affinity immobilize detergent-solubilized viral glycoproteins released in culture fluids of HIV-1 infected cell lines grown in serum free medium. Antibodies binding to ConA-immobilized viral antigens are detected by peroxidase-conjugated antibodies and appropriate enzyme substrates. Unlike most commercial HIV ELISAs, which utilize gp120 depleted-purified virus as the source of antigens and thus favor detection of antibodies to core antigens, the ConA envELISA is highly sensitive for detecting antibodies to native gp120, as evidenced by the strong reactivity of gp120-specific human monoclonal antibodies. Our results also suggest that representation of gp41 in the assay varies and depends on which virus infected cell lines are used for antigen production. Since this assay accurately identified 14 HIV-1 antibody positive patient sera and no false positives were detected among 16 HIV-1 negative sera, the ConA envELISA shows promise as an inexpensive assay for the serologic diagnosis of HIV infections.     

Sensitivity of a rapid point of care assay for early HIV antibody detection is enhanced by its ability to detect HIV gp41 IgM antibodies

BackgroundAnti-HIV-1 IgM antibody is an important immunoassay target for early HIV antibody detection.ObjectivesThe objective of this study is to determine if the early HIV antibody sensitivity of the 60 s INSTI test is due to detection of anti-HIV-1 IgM in addition to IgG.Study DesignTo demonstrate HIV gp41 IgM antibody capture by the INSTI HIV-1 gp41 recombinant antigen, an HIV-IgM ELISA was conducted with commercial HIV-1 seroconversion samples. To demonstrate that the INSTI dye-labelled Protein A-based colour developer (CD) has affinity to human IgM, commercial preparations of purified human immunoglobulins (IgM, IgD, IgA, IgE, and IgG) were blotted onto nitrocellulose (NC) and probed with the CD to observe spot development. To determine that INSTI is able to detect anti-HIV-1 IgM antibody, early seroconversion samples, were tested for reduced INSTI test spot intensity following IgM removal.ResultsThe gp41-based HIV-IgM ELISA results for 6 early seroconversion samples that were INSTI positive determined that the assay signal was due to anti-HIV-1 IgM antibody capture by the immobilised gp41 antigen. The dye-labelled Protein-A used in the INSTI CD produced distinct spots for purified IgM, IgA, and IgG blotted on the NC membrane. Following IgM removal from 21HIV-1 positive seroconversion samples with known or undetermined anti-HIV-1 IgM levels that were western blot negative or indeterminate, all samples had significantly reduced INSTI test spot intensity.ConclusionsThe INSTI HIV-1/HIV-2 Antibody Test is shown to detect anti-HIV-1 IgM antibodies in early HIV infection which enhances its utility in early HIV diagnosis.     

抗人类免疫缺陷病毒gp41和丙型肝炎病毒NS3杂交瘤细胞株的建立

目的为检测血清中人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）和丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）抗原提供血清学指标。方法用纯化的重组ＨＩＶ（ｇｐ４１）和ＨＣＶ（ＮＳ３）抗原蛋白作为联合免疫原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞与Ｓｐ２／０小鼠骨髓瘤细胞融合，并采用挑单个细胞的方法进行一次克隆。结果分别获得４株和６株能稳定分泌高效价抗ＨＩＶ（ｇｐ４１）和ＨＣＶ（ＮＳ３）抗原蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株。初步建立了双抗体夹心法检测ＨＩＶ（ｇｐ４１）和ＨＣＶ（ＮＳ３）抗原的酶联免疫吸附试验。结论本方法是建立单抗杂交瘤细胞株的快速方法，所建杂交瘤细胞株特异性强，效价高，分泌抗体性能稳定，有推广价值。     

抗人类免疫缺陷病毒gp41和丙型肝为病毒NS3杂交？…

目的 为检测血清中人类免疫缺陷病毒和丙型肝炎病毒抗原提供血清学指标。方法 用纯化的重组ＨＩＶ和ＨＣＶ抗原蛋白作为联合免疫原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取脾细胞与Ｓ２／０小鼠骨髓瘤细胞融合,并采用挑单个细胞的方法进行一次克隆。结果 分别获得４株和６株能稳定分泌高效价抗ＨＩＶ和ＨＣＶ抗的蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

人源抗人类免疫缺陷病毒1型基因工程抗体的初步研究

目的 构建噬菌体抗体库,筛选抗HIV-1抗体Fab,并对其进行鉴定.方法 采集无症状、HIV-1抗体滴度较高的HIV-1感染者全血,分离淋巴细胞并提取总RNA,经RT-PCR扩增人轻链基因和重链Fd基因.运用噬菌体展示技术,构建噬菌体抗体库,经过3轮"吸附-洗脱-富集"筛选,将获得的克隆进行诱导表达,表达产物经ELISA检测,筛选阳性抗HIV-1 Fab克隆;对获得的克隆进行抗体基因序列测定并分析序列同源性和互补决定区(CDRs);对获得的阳性克隆与轻链克隆CL8进行链置换并检测链置换前后抗体亲和力的变化;对获得的克隆进行诱导表达及纯化,同时进行中和试验.结果 构建了库容为8×106的噬菌体抗体库;经3轮筛选,获得11株抗HIV-1 Fab克隆,测序和序列分析显示,获得了 10条轻链和8条重链,它们和已经申请专利的部分HIV-1 gp120抗体的基因序列有较高的同源性(轻链同源性为60%～90%;重链同源性为71%～85%);CDRs分析显示,11株抗体CDRHs均比较长(12～20aa);链置换后的抗体亲和力并没有明显的改进;Fab诱导表达量均大于10 mg/L,利用重组HIV-1假病毒系统进行中和试验,结果显示,3株Fab具有一定的中和作用.结论 成功获得抗HIV-1抗体Fab,为进一步对其进行研究和应用奠定基础.     

抗日本血吸虫SEA特异性IgY应用于循环抗原检测的研究

本研究应用抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)建立敏感、特异的检测循环抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验( ELISA).用SEA皮下多点注射法免疫海蓝鸡,水稀释法制备IgY抗体,以辣根过氧化物酶标记纯化的IgY抗体(IgY-E)和兔抗IgG抗体(IgG-E)分别作为检测抗体,IgY抗体和兔抗...     

Analysis of the spontaneous in vitro anti-HIV-1 antibody secretion by peripheral blood mononuclear cells in HIV-1 infection.

We studied the spontaneous in vitro secretion of anti-HIV-1 antibodies by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HIV-1-infected patients. Specific antibody production was detected in supernatants of PBMC cultures using an ELISA; HIV-1 specificity was confirmed by antigen adsorption and Western blotting. This antibody secretion was found to be an active phenomenon and was not due to a release of plasma antibodies passively adsorbed onto the cell membranes. In all positive supernatants, anti-HIV-1-secreted antibodies were directed against env-encoded antigens and many supernatants also contained antibodies to pol- and gag-encoded antigens. PBMC from all HIV-1-infected patients tested (140 adults and 18 infants) secreted anti-HIV-1 antibodies. This production was found during all the clinical stages of HIV-1 infection. Our results suggest that this spontaneous HIV-1-specific antibody secretion represents a marker of HIV-1 infection. Detection of these antibodies could be a valuable tool for early confirmation of HIV-1 infection in neonates born to HIV-1-seropositive mothers.