遗传性蛋白S缺陷症家系基因突变的研究

目的 对2个遗传性PS缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测.方法 PS:A测定采用发色底物法;TPS:Ag、FPS;Ag测定采用ELISA法;PS基因(PROS1基因)检测采用PCR方法 对先证者PROS1基因的15个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序.结果 先证者1的PS:A为48.6%,FPS:Ag为41 mg/L,TPS:Ag为136 mg/L,PROS1基因2号外显子在c.C121T位点发生杂合碱基替换,导致编码的PS蛋白存在Arg-1 Cys(R-1C)杂合错义突变.先证者2的PS:A为29.2%,FPS;Ag为26 mg/L,TPS:Ag为83 mg/L,PROSl基因14号外显子在c.C1687T位点发生杂合碱基替换,导致编码的PS蛋白存在Gln522Stop杂合无义突变.结论 c.C121T是PROS1基因的一个新的突变位点,该杂合突变可以导致Ⅱ型遗传性PS缺陷症;c.C1687T杂合突变导致Ⅰ型遗传性PS缺陷症.     

遗传性蛋白S缺陷症家系基因突变的研究

Objective To identify the clinical phenotypic diagnosis and gene mutation detection of two kindreds with PS deficiency. MethodsPS: A was measured by chromogenic substrate method;TPS:Ag, FPS: Ag levels were measured by ELISA method; PS gene(PROS1 gene)was detected by amplifying 15 exons and flanking intron sequences from the propositus with PCR method. PCR products were purified and directly sequenced. Results For propositus 1,PS: A was 48.6% ,TPS: Ag was 136 mg/L, FPS : Ag was 41 mg/L, PROSI gene exon 2 was in c. Heterozygous base substitutions was detected in C121T locus, which led to Arg-1Cys (R-1C) heterozygous roissense mutation encoded in PS proteins. For propositus 2, PS: A was 29.2%, TPS: Ag was 83 mg/L, FPS: Ag was 26 mg/L, PROSI gene exon 14 was in c. Heterozygous base substitutions was identified in CI687T locus, in which Gln.522Stop heterozygous nonsense mutation was encoded in PS proteins. Conclusions c. C121T is a novel mutation locus detected in PROS1 gene. This heterozygous mutation could lead to type Ⅱ PS hereditary deficiency, while c. C1687T heterozygous mutation could bring about type Ⅰ PS hereditary deficiency.     

遗传性蛋白C缺陷症四个家系的分子发病机制研究

目的 对4个遗传性PC缺陷症家系进行临床表型诊断和基因型分析.方法 分别用发色底物法和凝固法测定4个家系先证者及家系成员的血浆PC:A、TPS:A和FPS:A;PC:Ag和FPS:Ag的测定采用ELISA法.采用凝血酶生成试验检测患者凝血功能的变化.PCR法扩增先证者PC和PS基因的全部外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.结果 先证者1的PC:A为36%,PC:Ag 为57%,TPS:A为48%,FPS:A为18%,FPS:Ag为23.7%,基因分析显示其PC基因2号、7号和8号外显子分别存在L-34P、K150del和A209V 的杂合突变,其中L-34P和A209V来自父亲,K150del来自母亲;先证者2的PC:A为46%,PC:Ag为64.4%,TPS:A为36%,FPS:A为19.5%,FPS:Ag为20.9%,其PC基因的2号和7号外显子分别存在T66C的多态性和R147W的杂合突变,PS基因的14号外显子存在Tyr519stop的杂合突变,其中PC突变来自母亲,PS突变来自父亲.凝血酶生成试验显示先证者2及其父母的抗凝功能减弱,其中PS缺陷的先证者和其父亲的外源性活化蛋白C抑制凝血酶生成的能力下降,而其母亲没有明显变化.先证者3的PC:A为33%,PC:Ag为48.42%,其PC基因同时存在R147W和R178W突变;先证者4的PC:A为21%,PC:Ag为18.36%,基因检测结果显示先证者4是R178W和D255H的双杂合子.结论 遗传性PC缺陷症或PC、PS联合缺陷症是导致4例先证者出现静脉血栓的原因.杂合PC基因突变(L-34P、A209V、R147W、R178W和D255H)是导致4例先证者遗传性PC缺陷症的原因.     

遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症一例家系基因缺陷研究

目的 分析1例遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症家系表型和分子遗传学特征,对凝血因子基因(F11)进行基因缺陷研究.方法 通过检测先证者及家系成员的活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、FⅪ促凝活性(FⅪ:C)和FⅪ抗原(FⅪ:Ag)等进行临床表型诊断,应用PCR对先证者F11基因15个外显子及其侧翼序列进行扩增,对PCR产物进行直接测序.对先证者及其父母、100名健康对照者DNA相应区域进行PCR扩增,内切酶BssSI酶切,以排除基因多态性并确认突变位点.应用分析软件SignalP对信号肽切割点及位置进行预测.结果 先证者APTT为69.5 s,PT为12.3 s,FⅪ:C为2.6%,FⅪ:AS为2.5%,交叉反应物质(CRM)为阴性;健康对照组APTT为35 s,PT为13 s,FⅪ:C为100%,FⅪ:Ag为100%.测序发现,先证者F11基因外显子区共有4处与GenBank AY191837序列不同的位点,其中外显子2的G3733C杂合变异导致编码信号肽的氨基酸G-1R替换,该突变同时导入1个新的BssSI酶切位点.100名健康对照者的BssSI酶切结果排除了该变异为F11基因多态性.外显子8的C16642T杂合突变导致1个终止密码(Q263Term)产生.结论 F11基因G-1R和Q263Term双重杂合突变是导致先证者遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症的分子发病机制.     

遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的凝血因子Ⅺ基因突变分析

Trp501Cys),5种无义突变(Trp501Stop、Arg479Stop、Trp228Stop、Gln263Stop和Trp383Stop),1种碱基缺失突变(1325t缺失).其中的Trp228Stop突变存在于7个家系中,可能为中国汉族人群中遗传性FⅪ缺陷症的突变热点.结论 所发现的13种FⅪ基因突变可能是导致中国汉族人遗传性FⅪ缺陷的分子发病机制.     

一个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系凝血因子Ⅻ基因分析

目的 对一个遗传性FⅫ缺陷症家系进行 FⅫ基因突变检测,探讨其参与的分子发病机制.方法 通过活化aPTT、FⅫ:C和FⅫ:Ag等测定进行表型诊断;用PCR技术对先证者及其家系成员FⅫ基因的14个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后,由DNA测序仪进行测序,发现突变位点则反向测序以证实.选择100名健康体检者作对照.结果 先证者及胞弟aPTT明显延长,分别为aPTT79.1s/35 s、aPTT 84.6 s/35 s,大儿子aPTT稍高,为42.1 s/35 s,家系其他成员aPTT正常范围.先证者及胞弟FⅫ:C极度降低,分别为2%、3%,其FⅫ:Ag水平均<1%;胞兄、大儿子和小儿子FⅫ:C明显下降,分别为39%、29%、34%,FⅫ:Ag水平分别为32%、30%、37%.先证者及胞弟FⅫ 1号外显子启动子区46位表现为46T/T型;5号外显子发现5741delc,5742delA,读码框移位,导致Set400Pro;10号外显子发现7142insertC,使得Lys346Gln终止密码子提前出现,产生截短蛋白.此外,家系其他成员:胞兄、大儿子及小儿子发现46T/T和7142insertC;小孙女发现46T/T;侄女、大孙女、二孙女发现46C/T.结论 在该遗传性FⅫ缺陷症家系发现常见的46C/T多态性及exon5区5741delC,5742delA与exon10区7142insertC.5741delC,5742delA及7142insertC与FⅫ水平的降低有关.     

遗传性蛋白S缺陷症一个新的基因突变

目的 研究一个遗传性蛋白S（PS）缺陷家系的遗传表型及基因型特征。方法 PS活性用凝固法测定,PS抗原用ELISA方法测定。用聚合酶链反应扩增5代家系34个成员中9个PS活性及抗原减低的PS1－15号外显子片段,用单链构象多态性（SSCP）分析cDNA变性后的差异,用测序方法检测突变点。结果 该家系5代9名成员游离PS抗原在10％－45％（正常值为55％－128％）。PS活性在13％－37％（正常值为70％－130％）,较正常参考范围明确降低,二者呈平行下降,但总PS抗原均在正常范围。在这些成员中均检测到10号外显子第163位核苷酸G→T突变,使AGT→ATT,在mRNA转录时,转录为终止密码子,阻断蛋白质的合成。结论 本家系的Ⅲ型PS缺陷症基因分析证明,先证者为杂合子型。在PS10号外显子上第163位核苷酸发生G→突变,在蛋白质合成过程中丝氨酸被终止密码子替代,为目前文献中尚未报道的一个新的基因突变点。     

遗传性低纤维蛋白原血症家系复合杂合基因缺陷的研究

目的 对1个遗传性低纤维蛋白原血症家系进行临床表型诊断和基因分析,并探讨该病的分子发病机制.方法 采集该家系3代共7人外周血,检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、蕲蛇酶时间(RT)、抗凝血酶活性(AT∶A)、蛋白C活性(PC∶A)和蛋白S活性(PS∶A),纤维蛋白原(Fg)抗原和活性分别用免疫比浊法和Clauss法测定;采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对先证者及其父母的血浆纤维蛋白原进行半定量检测及肽链相对分子质量分析;使用自动校正凝血酶生成仪测定先证者的凝血酶生成;应用血栓弹力图仪检测血液凝固的动态过程和纤维蛋白形成过程的动力学变化.抽提先证者及家系成员外周血基因组DNA,采用PCR扩增Fg的3个基因(FGA、FGB和FGG)所有外显子及其侧翼序列,DNA直接测序进行基因分析.结果 先证者凝血功能检查显示Fg抗原为0.68 g/L,活性为0.48 g/L; TT延长为29.2 s,RT延长为75.8 s.SDS-PAGE结果显示,3条肽链相对分子质量正常,但含量明显减低;先证者凝血酶生成峰值为249.93 nmol/L,凝血酶生成潜力为1007.0 nmol·L-1·min;全血凝固的动态过程异常,凝血综合指数(CI)为-8.6,显示全血低凝状态.表型诊断为遗传性低纤维蛋白原血症.基因分析发现先证者纤维蛋白原Aa链存在g.3175A＞C突变导致的Gln143Pro突变,以及g·4642delC 突变导致的438位苏氨酸后编码26个异常氨基酸提前出现终止密码子;前者来源于母亲,后者来源于父亲.结论纤维蛋白原Aa链Gln143Pro和g.4642delC复合杂合突变是导致该家系先证者低纤维蛋白原血症的原因.     

遗传性凝血因子X缺陷症三例及其分子发病机制研究

目的 对3个遗传性FX缺陷症家系进行临床表型和基因型研究,并探讨其分子发病机制.方法 对3例先证者进行止凝血筛查,检测APTT和PT;利用凝固法和ELISA检测FX∶C和FX∶Ag.采用交叉纠正试验排除血浆中FX抑制物的存在,采用凝血酶生成试验检测3例先证者及健康对照者血浆中凝血酶的生成.采用蛋白印迹半定量方法检测血浆中FX抗原浓度和相对分子质量大小.对FX基因采用直接测序进行基因诊断.构建突变型表达质粒,瞬时转染293T细胞,分别测定转染细胞裂解液及培养上清液中FX∶Ag,测定上清液中FX∶C,实验重复3次.结果 先证者1的APTT和PT均明显延长,分别为113.4 s和62.3 s,交叉纠正试验被纠正,血浆中几乎没有凝血酶的生成.先证者2的APTT和PT分别为56.5 s和28.7 s,交叉纠正试验也被纠正,血浆中凝血酶生成为1 101.5 nmol·min.先证者3的APTT和PT分别为117.3 s和44.3 s,交叉纠正试验被纠正,凝血酶生成为782.5 nmol·min.先证者1的FX∶C和FX∶Ag分别为1.4%和3.6%,基因诊断结果显示,FX基因存在纯合突变Ser425→Pro,该突变体外表达显示能够在细胞中正常合成,但分泌障碍;先证者2的FX∶C和FX∶Ag分别为2.2%和5.5%,FX基因存在双杂合突变Ala-29→Pro和Phe324→Leu,Ala-29→Pro突变导致FX表达量在细胞裂解液和培养上清液中均明显减少,分别为野生型质粒的(41.32±5.21)%和(6.30±1.84)%,而Phe324→Leu突变在细胞中几乎不影响FX的合成;先证者3的FX∶C和FX∶Ag分别为2.2%和35%,FX基因存在双杂合突变Ala235→Thr和Arg347→Cys,这2种突变使FX在细胞裂解液中与野生型蛋白表达量相似,而细胞上清液中较野生型蛋白明显减低,分别为野生型的(23.03±1.92)%和(42.51±2.07)%.结论 本研究发现了5种新的FX基因突变;其中Ser425Pro、Phe324Leu、Ala235 Thr和Arg347Cys突变不影响FX突变蛋白的合成,而Ala-29Pro突变则导致FX突变蛋白合成减少,伴分泌障碍.     

遗传性凝血因子ⅩⅢ缺陷症家系致病基因突变的鉴定

目的 分析一个遗传性凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)缺陷症家系中FⅩⅢ基因缺陷.方法 应用PCR结合直接测序法对先证者的FⅩⅢA链基因15个外显子及其侧翼序列进行分析,鉴别其中可能存在的基因变异.应用等位基因特异性扩增法或PCR限制性内切酶分析法,对该家系其他成员及100名健康体检者的FⅩⅢA基因进行检测.结果 先证者FⅩⅢA基因第3外显子和第4外显子分别存在Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变,后者是人FⅩⅢA基因一种新突变.家系分析表明这2个突变是双重杂合子型,Arg77Cys突变遗传自父亲,Arg174stop突变遗传自母亲.先证者女儿携带Arg77Cys错义突变.先证者丈夫及100名健康对照者均未发现Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变.结论 发现人FⅩⅢA基因的一种新突变,即Arg174stop无义突变,并对此突变成功地运用了PCR限制性片段长度多态性方法 检测.先证者FⅩⅢA基因同时存在Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变,可能是其FⅩⅢ先天性缺陷的原因.     

1例遗传性蛋白S缺陷症患者的基因分析

目的研究一个遗传性蛋白S(PS)缺陷症家系的表型诊断及基因特征。方法PS活性(PS:A)用发色底物法测定,PS抗原(PS:Ag)用ELISA方法测定。用PCR扩增PS基因各个外显子及侧翼序列,用直接测序法检测突变点。结果先证者的PS:Ag和PS:A分别为8·3mg/L和29%,均低于正常。基因检测发现在14号外显子Gln522(CAG)→Stop(TAG)。结论本家系PS基因在14号外显子Gln522(CAG)→Stop(TAG),为国内首次报道的一个新的基因突变。     

一例遗传性蛋白C缺陷症家系的实验诊断

目的对1例遗传性蛋白C缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测。方法用发色底物法测定血浆蛋白C活性;用聚合酶链反应（PCR）法对先证者PC基因（PROC）的9个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。家系成员DNA在先证者PROC基因突变区域扩增后测序,进行家系调查以期发现遗传规律。结果先证者蛋白C活性为38.6%,抗原为45.3%。直接基因测序分析发现先证者PROC基因外显子7区存在杂合错义突变c.565C〉T,该突变将引起编码的蛋白C 147位精氨酸被色氨酸替换（p.Arg147Trp）。家系分析发现先证者的c.565C〉T突变遗传于其父亲。结论 c.565C〉T杂合突变是导致该家系遗传性PC缺陷症的原因。     

遗传性蛋白C缺陷症家系的一个基因突变

目的 研究一个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系的遗传表型及基因特征。方法 PC活性用凝固法测定，PC抗原用ELISA方法测定。用PCR扩增2代家系12个成员中4个PC活性及抗原减低的PCⅡ-Ⅸ号外显子片段，用单链构象多态性（SSCP）分析cDNA变性后的差异，用测序法检测突变点。用限制性酶切验证突变点，同时分析家系的基因型。结果 该家系2代4名成员PC抗原水平在34．3％－67．8％（参考值80％－120％）。PC活性在22％－49％（参考值70％－130％），较正常参考范围明显减低。限制性酶切分析该家系12名成员时发现9名成员存在基因的突变。基因突变位点在Ⅶ号外显子第6219位核苷酸G→A突变，使正常编码的CGG精氨酸突变为CAG谷氨酰胺。结论 该家系为I型PC缺陷症，基因分析证明先证为杂合子型。在PCⅦ号外显子上第6219位核苷酸G→A突变，在蛋白质合成过程中第169位精氨酸被谷氨酰胺替代（R→Q），为目前国内献中尚未报道的一个基因突变点。     

两个终止密码子导致的遗传性蛋白C和蛋白S缺陷症

目的:研究1个蛋白C(PC)和1个蛋白S(PS)缺陷症家系的表型诊断和基因特征。方法:PC活性(PC:A)和PS活性(PS:A)用发色底物法测定;PC抗原(PC:Ag)和PS抗原(PS:Ag)用ELISA方法测定。用PCR扩增PC和PS基因各个外显子及其侧翼序列,用直接测序法检测突变点。利用逆转录PCR(RT-PCR)分析PCmRNA水平变化。同时利用蛋白印迹分析血浆中PC含量的变化。结果:先证者1的PC:A为49%,PC:Ag为1.34mg/L,基因检测发现PC基因9号外显子的8831有G→A杂合无义突变,导致Trp372Stop;先证者2的PS:A为29%,PC:Ag为8.3mg/L,14号外显子Gln522(CAG)→Stop(TAG)。结论:G8831A杂合突变引起Trp372Stop,其可导致遗传性PC缺陷症;Gln522Stop可导致遗传性PS缺陷症。     

遗传性多发性骨软骨瘤EXT基因的一种新突变

目的：对1个遗传性多发性骨软骨瘤（HME）家系的EXT1和EXT2基因编码序列进行突变检测，寻找引起该家系HME的致病基因突变。方法：应用PCR扩增先证者EXT1和EXT2各外显子及其侧翼序列，产物经割胶纯化后，直接测序分析。结果：DNA测序分析发现，先证者EXT1基因第7外显子区有一杂合缺失突变，为1564．7delC，导致522位后编码氨基酸发生移码突变，并在546位引入终止密码，使编码的EXT1蛋白为截断型蛋白。经家系调查发现．该突变来自先证者的母亲。先证者EXT2基因未发现突变。结论：EXT1基因1564—7delC杂合突变是引起该家系HME的分子机制。     

复合杂合突变导致遗传性蛋白C缺陷症- -家系调查

摘要:目的调查复合 杂合突变导致遗传性蛋白C缺陷症家系的临床特征与基因突变情况,并分析其基因型与临床表型的关系。方法采集先证者及其家系成员(3代5人)外周静脉血，检测蛋白C活性、蛋白S活性和抗凝血酶活性等指标以明确表型 诊断。采用PCR对先证者PROC基因所有外显子及侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后进行直接测序。运用ClustalX-2. 1-win软件分析突变的保守性;使用在线生物信息学软件预测突变的致病性。结果家系中有4人 存在遗传性蛋白C缺陷症,先证 者临床表现为肺栓塞和下肢深静脉血栓栓塞,其他家系成员无明显的血栓形成事件表现。基因测序发现先证者PROC基因第7号外显子存在c.541T>G 杂合错义突变(p. Phe181Val)和c.577-579delAAG杂合缺失突变( p. Lys192deletion),其父亲为 c.541T>G突变杂合子，母亲和妹妹为c.577-579delAAG 突变杂合子。保守性分析显示Phe181和Lys192在同源物种间均高度保守,生物信息学软件预测该2个突变位点均为有害突变。结论该遗传性蛋白 C缺陷症家系存在c.541T>G杂合错义突变 和e.577-579delAAG 杂合缺失突变,该复合杂合突变可能引起先证者蛋白C活性明显降低,从而导致反复深静脉血栓栓塞和肺栓塞。