野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

KiSS-1基因对卵巢癌细胞HO8910生物学行为影响的实验研究

目的探讨肿瘤转移抑制基因KiSS1对卵巢癌细胞株HO8910生物学行为的影响。方法含有人KiSS1基因全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3KiSS-1经酶切和测序鉴定正确后,转染卵巢上皮癌细胞株HO8910,观察其KiSS1mRNA表达、细胞生长及增殖能力和细胞侵袭力的变化。结果pcDNA3KiSS1成功转染HO8910细胞,KiSS1mRNA表达阳性,而亲本HO8910细胞为阴性。转染目的基因后细胞生长曲线、软琼脂克隆形成率等与未转染之细胞无显著性差异(P>0.05),但细胞侵袭能力明显下降(P<0.01),穿透Matrigel膜细胞数较未转染组明显减少(P<0.01)。结论KiSS1基因对卵巢上皮癌细胞HO8910的生长、增殖能力无影响,但可抑制其侵袭能力。     

人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因在CHO细胞的稳定表达及功能研究

目的将人脑源性神经生长因子（hBDNF）基因转染CHO细胞后,建立稳定表达体系,并检测培养上清中所表达的hBDNF的生物学活性。方法采用脂质体介导的真核细胞转染,运用RT-PCR,Western blot及MTT法进行检测分析。结果转染hBDNF基因的CHO细胞可表达hBDNF mRNA,上清中可检出hBDNF蛋白的存在,且此上清具有促进PC12细胞生长和分化的功能。结论成功地建立了hBDNF在CHO细胞中的稳定表达体系,转染hBDNF基因的CHO细胞所分泌的hBDNF蛋白具有较高的生物学活性,为进一步研究BDNF的生物学功能和开展生物治疗奠定了实验基础。     

Tumstatin-EGFP在CHO细胞中的表达和活性分析

目的分析融合蛋白tumstatin-EGFP在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达及生物学活性。方法经过酶切和测序正确的真核表达载体PIRESneo3/STL-EGFP、PIRES-neo3/sig-EGFP和空载体稳定转染CHO细胞后,用Western blot从细胞上清液中检测融合蛋白的表达、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。通过生长曲线分析外源基因的导入对CHO细胞生长的影响,MTT法和管状形成抑制试验评估tumstatin-EGFP融合蛋白的tumstatin样活性,体外靶向试验验证tumstatin能否携带融合蛋白特异性结合内皮细胞。结果获得了稳定转染的CHO细胞系。生长曲线表明转染后的较未转染的CHO细胞生长缓慢,MTT试验和管状形成抑制试验分别证实了融合蛋白tumstatin-EGFP具有抑制内皮细胞增殖,明显抑制血管管状结构的形成的作用;体外靶向试验也验证了tumstatin-EGFP能够特异性结合内皮细胞。结论重组真核表达载体在CHO细胞获得稳定表达,融合蛋白tumstatin-EGFP的表达不影响tumstatin和EGFP各自的生物学活性,并且在体外tumstatin能特异性携带EGFP靶向内皮细胞,为进一步tumstatin及其融合蛋白的研究奠定基础。     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

人多药耐药基因1在CHO细胞中的表达及功能研究

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的真核表达载体,转染CHO细胞,研究MDR1基因在真核细胞中的表达及功能.方法:将MDR1全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ),利用阳离子脂质体转染CHO细胞,RT-PCR检测MDR1转染阳性细胞,并用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,通过测定细胞对Rh123的外排作用以及对阿霉素的耐受性确定MDR1基因在正常细胞中的功能.结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-MDR1序列正确.RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该重组表达载体已在CHO细胞中有效转录并稳定表达.Rh123外排和MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-MDR1的CHO细胞对Rh123外排作用显著高于未转染的CHO细胞,并且转染后的CHO细胞对阿霉素的耐药性也有显著提高.结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药功能的细胞株,有望成为多药耐药性药物研究的细胞模型.     

人β-NGF基因在CHO细胞中表达的活性检测

目的 检测人β-NGF基因转染CHO细胞后培养上清中所表达的β-NGF的生物学活性。方法 采用脂质体介导的真核细胞转染，运用MTT法进行检测分析。结果 转染β-NGF基因的CHO细胞可分泌能促进PC12细胞生长的活性β-NGF。结论 转染β-NGF基因的CHO细胞所分泌的β-NGF接近自然合成的蛋白。具有较高的生物学活性。为NGF的生物制药奠定了实验基础。     

凋亡素在体外对人卵巢癌细胞及正常卵巢细胞凋亡的影响

目的　探讨凋亡素基因 (VP3)表达对人卵巢癌细胞和正常卵巢细胞凋亡的影响。方法　采用LipofectamineTM2 0 0 0介导的基因转染方法将重组凋亡素真核表达质粒pcDNA3.1 -VP3 导入仓鼠正常卵巢细胞CHO -K1、人卵巢癌细胞CoC1及人卵巢癌细胞耐药亚株CoC1 DDP。结果　凋亡素基因已在转染细胞中存在并在转录水平表达 ;CHO -K1中凋亡素组与空质粒组凋亡率差异无显著性 (P >0 .0 5 )。CoC1和CoC1 DDP中 ,凋亡素组凋亡率明显高于空白对照组和空质粒组 (P <0 .0 1 ) ,且凋亡素更易诱导CoC1 DDP细胞凋亡 (P <0 .0 1 )。结论　在转染细胞中凋亡素基因在转录水平得到表达 ;凋亡素能特异性诱导人卵巢癌细胞CoC1及人卵巢癌细胞顺铂耐药亚株CoC1 DDP凋亡 ,不影响正常卵巢细胞CHO -K1 ;凋亡素更易诱导卵巢癌顺铂耐药亚株CoC1 DDP细胞的凋亡     

重组人类杀菌肽基因在CHO细胞中的表达

目的 检测重组人类杀菌肽基因（BPI）在真核细胞中的表达.方法 采用脂质体转染法将本室构建的pCDNA3.1-BP1500及pCDNA3.1-BPI600重组子导入中国仓鼠卵巢上皮细胞（CHO）,G418筛选出带有重组子的细胞集落,RT-pCR检测BPI在CHO细胞集落中的表达.结果 转染后G418抗性CHO细胞中可检测到BPImRNA的表达.结论 pCDNA3.1-BPI重组子被成功转染至CHO,并得到有效表达.     

Livin基因特异性siRNA对肝癌细胞增殖、转移的影响

目的 应用PNA干扰技术抑制人肝癌细胞株SMMC-7721中凋亡抑制因子livin表达,研究livin基因对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对hvin β基因的siRNA真核表达栽体pU-livinβ-siRNA,将其表达栽体经脂质体LipofectamineTM2000转染至肝癌细胞株SMMC-7721细胞,采用RT-PCR、Western blot方法检测转染后的SMMC-7721细胞中livin β基因的mRNA和蛋白质表达,了解转染效率.通过流式细胞仪分析细胞周期的分布,并应用Transwell侵袭小室模型观察转染后SMMC-7721细胞恶性生物学行为的变化.结果 在pU-livinβ-siRNA转染后的SMMC-7721细胞中,livinβ基因的mRNA和蛋白质表达显著下降(P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降.结论 通过RNAi技术阻断livin的表达,可抑制SMMC-7721细胞的生长、增殖、迁徙,提示Livin基因在肝癌的发生、发展过程中起重要作用.