用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应

本研究探讨转染survivin（SVV）基因的树突状细胞（DC）体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养,以Ad-SVV转染DC,用Westernblot鉴定Survivin的表达,用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应,用混合淋巴细胞反应（MLR）测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,以ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12含量。结果表明：在MLR中,刺激应答比（S/R）为1∶5、1∶10、1∶50和1∶100时,转染Ad-SVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;转染Ad-SVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组;转染病毒后第2天,转染Ad-SVV的DC组的IL-12分泌水平高于对照DC组。结论：含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应,对CA46细胞有明显的杀伤作用。     

细胞因子体外诱导慢性髓细胞性白血病树突状细胞分化的研究

本研究探讨干扰素（IFN）治疗慢性粒细胞性白血病（CML）的可能新机制，为临床治疗CML提供新的思路。用Ficoll密度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC），用不同细胞因子组合体外诱导培养树突状细胞（DC），在倒置显微镜及光镜下观察DC形态，应用流式细胞术检测其表面标志（CD1a，CD83，CD86，HIA-ABC，HIA-DR，CD54）。MTT法检测其混合淋巴细胞反应（MLR）能力。结果表明：经不同细胞因子组合所诱导出的DC，其特征性表面分子表达率均高于培养前的DC（P〈0．01）；IFN-α＋GM-CSF组DC表达HLA—ABC、HLA-DR明显高于IL-4＋GM-CSF培养组（P〈0．05）；而IFN-α＋GM-CSF4-IL-4组DC的CD86表达率及MLR水平均高于其它细胞因子组合组（P〈0．05）。干扰素耐药组DC表面分子表达率及MLR水平较新诊断组和干扰素治疗有效组均明显减低（P〈0．05），但A、B、C各组的CD86表达率及MLR水平在IFN-α＋GM-CSF4-IL-4因子组合条件下无明显差异。结论：CML骨髓单个核细胞在含有IFN-α的细胞因子组合条件下可分化为具有形态和免疫表型特征的DC，且表达较高的Ⅰ类和Ⅱ类分子、共刺激分子、黏附分子及MLR，表明干扰素治疗CML的机理可能与DC有关，这一结果提示通过增强内源性DC功能可能提高CML临床疗效。     

重组人p53腺病毒转染淋巴瘤源性树突状细胞的抗肿瘤免疫效应

本研究旨在探讨重组人p53腺病毒转染淋巴瘤源性树突状细胞的抗肿瘤免疫效应。采集初诊弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者肿大的淋巴结和外周血,分别分离单个核细胞,进行树突状细胞(DC)体外诱导培养,均分为实验组(rAd-p53-DC)、对照组(rAd-DC)和空白对照组。用重组人p53腺病毒(rAd-p53)转染2种来源的DC,流式细胞术检测DC免疫表型,Western blot鉴定P53蛋白的表达,ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12的含量,用混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测经rAd-p53转染的两种来源DC的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。结果表明,实验组DC的表型(CD1a除外)CD83、CD80、CD86和HLA-DR表达均较对照组及空白对照组明显增高(P<0.05)。实验组P53蛋白的表达上调,培养上清液中IL-12分泌水平较对照组及空白对照组明显增高(P<0.05)。实验组明显刺激自体淋巴细胞增殖,且刺激能力随rAd-p53-DC与淋巴细胞比例的增加而升高。对照组及空白对照组也能刺激同种自体淋巴细胞增殖,但较实验组差(P<0.05)。对靶细胞的细胞毒作用(CTL效应)检测显示,实验组介导同种异体的淋巴细胞杀伤率显著高于对照组及空白对照组(P<0.05),且淋巴结来源DC的CTL效应明显高于外周血来源DC(P<0.05)。结论:rAd-p53-DC为基础的肿瘤疫苗有可能在解决淋巴瘤的微小残留病、DC免疫耐受等问题方面发挥作用。     

白介素21对树突状细胞诱导的CTL抗白血病作用的影响

本研究探讨白介素21（IL-21）对树突状细胞（DC）诱导的CTL抗白血病的体外作用。以不同细胞因子诱导培养急性白血病（AL）患者缓解期外周血单个核细胞产生DC，自体AL细胞RNA作为抗原负载DC，与自体T淋巴细胞共培养诱导白血病特异性CTL产生；用LDH释放法检测CTL杀伤自体AL细胞的作用，并检测CTL产生IFN-γ和TNF-α的变化。实验共分2组：实验组，在DC—CTL共培养过程中加用IL-21（200ng／ml）；对照组，不加IL-21。同时对IL-21单独作用培养后成熟DC，检测其表面抗原表达变化以及诱导同种混合淋巴细胞反应能力。结果表明：对照组和实验组的CTL产生率分别为：（56．73±10．21）％，（73．43±18．01）％（P〈0．01）；培养上清中IFN-γ和TNF-α分别为：（154．91±67．20）ng／L，（310．62±141．15）ng／L（p〈0．01）和（8．77±5．09）μg/L，（15．25±6．56）μg／L（p〈0．01）。在效靶比为20：1时，两组对自体AL细胞的杀伤作用分别为（50．22±5．07）％，（75．38±9．47）％（P〈0．01）；IL-21作用后的成熟DC的CD1a、CD83、CD86、CD80和HLA—DR表达没有明显变化；诱导同种混合淋巴细胞反应能力亦没有明显不同。结论：IL-21可促进DC诱导的CTL增殖、增加IFN--γ和TNF—α产生从而增强其抗白血病作用；IL-21对成熟DC表面抗原表达及其免疫功能无明显影响；提示IL-21在白血病免疫治疗中发挥一定的作用，具有潜在的临床应用价值。     

硒与树突状细胞对T细胞杀伤白血病细胞活力的影响

本研究探讨经亚硒酸钠（Na2SeO3）处理、K562细胞裂解物冲击致敏的外周血衍生的树突状细胞（DC）的生物学特性和体外诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答的能力。健康人外周血单个核细胞（PBMNC）于体外在含3种细胞因子（rhGM—CSF、rhIL-4、TNF-α）的RPMI1640＋10％FBS培养液中培养4天，收获贴壁细胞，实验分4组：DCⅠ组：仅含DC；DCⅡ组：DC＋Se（0．5μmol／L）；DCⅢ组：DC＋K562细胞裂解液；DCⅣ组：在DCⅢ组中加入Se（0．5μmol／L）。在培养的第7天于倒置显微镜下进行活细胞观察。用流式细胞术（FCM）检测细胞表型CD1a、CD40、CD83、CD86。乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测CTL效应。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IL-12含量。结果表明：各组DC均具有典型树突状细胞形态，均较培养前集落增多。DCⅠ组和DCⅡ组的细胞形态及数量无明显差异，DCⅢ组和DCⅣ组的细胞集落数量增加，悬浮细胞比例增加。各组DC细胞的CD1a、CD40、CD83、CD86表达率较PBMNC明显增高（P〈0．01），各组间DC细胞的CD1a和CD40的表达率无明显差异，DCⅢ组和DCⅣ组的CD83和CD86的表达率均高于DCⅠ组和DCⅡ组（P〈0.01），DCⅠ和DCⅡ以及DCⅢ和DCⅣ两组之间CD83和CD86表达率均无明显差异。在效靶比例为25：1时，各组DC致敏的T淋巴细胞对K562细胞的杀伤率为15．3±2．3％、26．3±3．7％、28．2±4.5％和36．2±3．7％，均明显高于未经DC致敏的单独T淋巴细胞组（5．9±2．4％）（P〈0．01），DCⅣ组的CTL效应最强，高于DCⅠ、Ⅱ、Ⅲ组（P〈0．01），DCⅡ和DCⅢ组的CTL效应也高于DCⅠ组（P〈0．01），而DCⅡ和DCⅢ两组间CTL效应程度无明显差异（P〉0.05）；各组DC与T淋巴细胞共培养的上清液中IL-12水平为256．96±64．2、328．12±43.9、322．98±53．5和353.85±46．2pg／ml，均显著高于未经DC致敏的单独T淋巴细胞组（35?     

慢性重型乙型肝炎患者外周血树突状细胞表型和功能的研究

目的:研究慢性重型乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)表型、免疫功能和分泌细胞因子的特性。方法:从20例慢性重型乙型肝炎患者和10例健康人外周血中分离单个核细胞培养DC,用流式细胞仪检测DC的表面标志CD80和CD86的表达。用3H-TdR掺入法检测DC诱导混合性淋巴细胞反应(MLR)的能力。并用ELISA方法检测MLR中细胞因子IL-12的分泌水平。结果:慢性重型乙型肝炎患者组的DC细胞CD80、CD86的表达率较正常人组高(P0.05),诱导MLR的能力也较强(P0.05),MLR中细胞因子IL-12的分泌水平也较高(P0.05)。结论:慢性重型乙型肝炎患者外周血树突状细胞免疫功能亢进,免疫刺激能力也较高。     

抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究

本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC），分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以探讨其对白血病Jurkat细胞的杀伤作用。联合应用rhGM—CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC。实验分4组：冻融抗原致敏DC组为实验组A，WT1多肽致敏DC组为实验组B，未致敏DC组为对照组A，单核细胞组为对照组B，观察CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。结果表明：培养出了具有典型特征的DC，它高表达CD40、CD80、CD1a及CD86等表面标志，能体外诱导强烈的同种异基因混合淋巴细胞增殖反应。实验组显示高水平杀伤率，与对照组比较均具有统计学意义（P〈0.01），实验组A、B间比较无统计学意义。结论：Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC能有效诱导T细胞抗白血病作用，为临床研制DC疫苗提供了实验依据。     

丹参酮ⅡA对初治、复发及耐药人急性早幼粒细胞白血病细胞体外诱导分化作用

丹参酮ⅡA（TanⅡA）是从活血化瘀中药丹参中提取的有效成分。体外研究表明，TanⅡA对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用及诱导分化作用。近来有学者发现，0．5μg／ml TanⅡA在体外能诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞及维甲酸耐药APL细胞株MR-2细胞分化成熟。在此基础上，我们选择11例临床初治、复发及全反式维甲酸（ATRA）耐药的APL患者白血病细胞进行原代培养，进一步证实TanⅡA对APL细胞体外诱导分化作用，为其临床运用提供更加可靠的实验室依据。     

致敏的脐血源树突状细胞诱导CTL特异杀伤白血病细胞的实验研究

探讨脐血单个核细胞（MNC）诱导的树突状细胞（DC）通过负载冻融的HL-60、K562细胞抗原体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HL-60、K562的杀伤作用。取脐血12份,分离MNC。在MNC中加入细胞因子GM-CSF（granulocyte monocyte colony-stimulating factor）、IL-3（interleukin 3）、SCF（stemcell factor）和EPO培养4周。使用CD83、CD1a、CD11C和CDw123单克隆抗体、流式细胞仪测定培养前后脐血DC抗原变化及扩增情况。DC通过负载HL-60、K-562白血病细胞抗原致敏T淋巴细胞产生CTL^3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性。结果表明：新鲜脐血CD1a^＋、CD11c^＋、CD83^＋、CDw123^＋细胞数分别为0．27×10^5／ml、5．87×10^5／ml、1．94×10^5／ml、2．73×10^5／ml。加入上述细胞因子培养的脐血MNC分化为CD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC,经培养2—4周,DC数明显增多,分别达11．02×10^5／ml、28．24×10^5／ml、10．57×10^5／ml、18．7×10^5／ml,此后逐渐减少。细胞因子诱导脐血DC具有免疫刺激活性,且DC与CBMNC细胞比例为1：40时的刺激活性最佳。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为（42．04±8．46）％和（31．25±11．07）％,与实验组比较有显著性差异（P〈0．01）。结论：加入细胞因子GM—CSF、IL-3、SCF和EPO培养2-4周的脐血MNC可分化为cD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC,其诱导的CTL对HL-60、K562细胞具有特异的杀伤作用。脐血DC作为抗原呈递细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用。     

抑制VEGF表达对白血病来源树突状细胞免疫功能的影响

目的：探讨抑制血管内皮生长因子（VEGF）对白血病来源树突状细胞（Dc）免疫功能的影响。方法：利用反义寡核苷酸下调K562白血病细胞VEGF表达，K562细胞经细胞因子作用诱生白血病DC。利用MTT法检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤活性；ELISA法检测DC培养上清液中IL-12及DC与外周血单个核细胞（PBMNC）共同培养液中IFN-γ的含量。结果：K562细胞经5μmol／LVEGF反义寡核苷酸处理24h后VEGF蛋白分泌下降59％，其诱生的DC与正常K562来源的DC相比，实验组DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血单个核细胞分泌TNF-γ的能力明显增强。结论：抑制VEGF表达可促进白血病来源DC免疫功能的成熟。     

青蒿琥酯诱导凋亡的U937细胞负载树突状细胞后的免疫应答

本研究探讨凋亡白血病细胞负载的树突状细胞（dendritic cells,DC）能否诱导特异性细胞毒T淋巴细胞反应。用青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡,从正常人外周血单个核细胞诱生DC,将凋亡U937细胞负载DC,并添加TNF-α诱导DC成熟,然后与自体T淋巴细胞共育,并联合IL-2以诱生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）;应用流式细胞术分析DC和T细胞免疫表型,采用Dextran-FITC内吞试验检测DC的抗原摄取能力;用ELISA法检测IL-12p70的产生;采用MTT法检测凋亡U937细胞负载及未负载DC诱导的自体T淋巴细胞对不同的靶细胞（U937细胞和NB4细胞）的杀伤效应。结果表明：青蒿琥酯1μg/ml作用于U937细胞48小时后,U937细胞的凋亡率达51.52%,DC在未成熟阶段时吞噬Dextran-FITC的能力最强,负载凋亡U937细胞之后并不能促使未成熟DC（iDC）分化为成熟DC（mDC）。凋亡U937细胞负载后的iDC在TNF-α的作用下能够成为mDC。与未负载的mDC相比,凋亡U937细胞负载后的mDC（mDC-^ApoU937）分泌IL-12p70水平明显增高,而且由其所激发和扩增的T细胞以CD8^＋的T细胞为主。细胞毒性实验显示：mDC-^ApoU937诱导的T细胞的对U937细胞的杀伤显著超过对NB4细胞的杀伤。结论：mDC-^ApoU937能有效地诱导特异性抗白血病效应。     

小鼠调节性树突状细胞分泌的外泌体诱导免疫耐受的实验研究

本研究探讨小鼠调节性树突状细胞（rDC）分泌的外泌体（regulatory exosomes，rDex）诱导免疫耐受的作用，并与正常未成熟树突状细胞的外泌体（immature exosomes，iDex）诱导免疫耐受的作用进行比较。取C57BL／6（H-2^b）小鼠骨髓细胞诱导未成熟树突状细胞（iDC），TGF—β1联合IL-10诱导调节性树突状细胞（rDC），流式细胞术检测两种DC的表型。采用超速离心结合膜超滤的方法分别提取rDex和iDex。建立小鼠皮肤移植模型．以C57BL／6小鼠为供者，以BALB／c（H-2^d）小鼠为受者，按对受者处理的不同实验分3组，iDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10μg供者的iDex，rDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10μg供者的rDex，另设PBS对照组，观察移植皮肤存活情况。通过单向混合淋巴细胞反应（MLR）观察供者及非亲缘异基因供者DBA／2对同种异基因小鼠T细胞增殖情况。结果表明：TGF—β1、IL-10可下调DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达。移植皮片平均存活时间（MST），在对照组为7、8天，iDex组为10．7天，rDex组为18．8天；iDex组的移植皮片MST明显长于对照组（P〈0．05）；rDex组的移植皮片MST明显长于iDex组（P〈0．01）。MLR结果证明iDex组和rDex组B／C小鼠均对C57小鼠的脾细胞产生特异性耐受，尤其是rDex组；对非亲缘异基因DBA供者的脾细胞两组仍表现出强烈的免疫应答。结论：iDex和rDex均有诱导免疫耐受的作用，且rDex作用较iDex作用好。     

白血病细胞系来源的树突状细胞诱导及其抗肿瘤免疫功能研究

树突状细胞（DC）在抗肿瘤免疫反应中起关键作用，但大多数白血病病病人有DC功能缺陷，在外体扩增DC并增强其抗肿瘤免疫功能及以DC为基础的肿瘤疫苗是对白血病有效的免疫治疗方法，为了探讨由不同的髓性白血病细胞诱生DC的条件及其抗白血病反应，选用HL－60，K562和THP－1细胞与不同的细胞因子组合诱生DC，以光学和电子显微镜术观察形态特征，用流式细胞术和单克隆抗体检测细胞表型，以同种混合淋巴细胞反应观察刺激淋巴细胞增殖，用^51Cr释放法检测诱生细胞的细胞术和单克隆抗体检测细胞表型，以同种混合淋巴细胞反应观察刺激淋巴细胞增殖，用^51Cr释放法检测诱生细胞的细胞毒作用，用ELISA法测定DC培养及DC＋血单个核细胞培养的血清中IL－12及INF－γ的量，结果表明，由K562，HL－60和THP－1细胞诱生的DC具有村突状细胞的形太学特征，细胞表达DC的表面分化抗原，其中GM－CSF＋IL－4＋TNF-γ刺激HL－60－DC和THP－DC和GMCSF＋IL－4＋IL－12刺激的K562－DC中有抗原表达。3种细胞诱生的DC对混合淋巴细胞反应CTL反应有强刺激细胞因子能诱导髓性白细胞产生DC，不同细胞需要不同的细胞因子和培养条件，这些DC表达抗原呈递细胞的表型具有刺激T淋巴细胞增殖和诱导CTL反应以及分泌IL－2和促进T细胞分泌INF－γ的作用。     

低温保存对白血病源性树突状细胞的影响

本研究观察低温保存对白血病源性树突状细胞（L-DCs）的生物学特性和功能的影响。取急性、慢性髓系白血病骨髓细胞,将其一部分细胞立即检测,一部分细胞立即培养,一部分细胞加入细胞保护剂低温保存一定时间复温后培养。细胞培养时,在细胞培养体系内加入组合细胞因子并培养12天,然后分别检测3组细胞的细胞形态、细胞免疫表型、混合淋巴细胞反应及细胞毒T淋巴细胞（CTL）效应,并对结果进行相互比较分析。结果表明：在细胞形态学方面,急性、慢性髓系白血病患者骨髓细胞在不染色或在瑞氏染色下仅见白血病细胞,而未观察到“树突状”细胞,但经组合的细胞因子培养后,均出现了“树突状”形态的细胞,低温保存前、后二者比较,无明显差异;在细胞表面免疫标志表达方面,经组合细胞因子培养的细胞与未培养的细胞相比,细胞表面表达的CD80、CD54、HLA-DR、CD1a、CD83、CD86明显上调,而CD14表达则明显下调,低温保存前、后的细胞在上述几种细胞表面免疫表达指标方面相比较无明显差异;低温保存后的白血病细胞经培养后,不仅有明显的混合淋巴细胞反应,而且在与T细胞作用后T细胞表面抗原CD8和CD25免疫标记细胞明显增多,明显地表现了CTL杀伤自体白血病细胞的效应。结论：髓系白血病细胞在组合细胞因子培养条件下,可诱生为L-DC;L-DC的诱生在生物学特性方面不受低温保存的影响。     

树突状细胞对自体自然杀伤细胞体外扩增及功能的影响

本研究探讨树突状细胞（DC）对自体自然杀伤（NK）细胞体外扩增和功能的影响及其机制。用干细胞培养液（SCGM）在37℃、5％CO2、饱和湿度培养条件下以rhIL-2体外扩增NK细胞10天后，将自体DC与NK细胞以5：1（5：1组）和1：1（1：1组）的比例混合继续培养。14、21天时计算5：1组、1：1组和对照组的NK细胞扩增倍数，流式细胞术测定细胞表面CD3、CD56／16的表达，MTT法检测NK细胞的功能，ELISA法检测各培养组上清液中TNF-α和IL-12p70的含量。结果表明：14天时5：1、1：1组和对照组的扩增倍数分别为29．25±4．01、21．23±2．91和16．26±1．58，3组间比较差别有统计学意义（P〈0．05）。同组不同时间比较，14天时扩增倍数最高（P〈0．05）。14天时3组CD3^-、CD56／16^＋表达率分别为（64.6±7.8）％、（50．6±8.7）％和（34．8±5．1）％，5：1组表达率最高（P〈0．05）。14天时3组对K562细胞的杀伤率分别为（87.4±6．8）％、（75.4±6．3）％和（63．7±3.8）％，5：1组杀伤活性明显高于其它2组（P〈0．05）。5：1组上清液中TNF—α和IL-12p70的含量均分别高于其它各组（P均〈0．05）。结论：DC与NK细胞混合培养，能以比例依赖的方式增加NK细胞的扩增倍数，增强NK细胞的功能。DC增加NK细胞的扩增倍数与DC分泌的IL-12有关，NK细胞功能增强与NK细胞分泌的TNF—α增高有关。