B型肉毒毒素重链C端基因的克隆与表达

目的:扩增B型肉毒毒素重链C端基因并将其在大肠杆菌中表达.方法:首先克隆B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc),经IPTG诱导,在大肠杆菌中进行天然序列的表达.构建原核表达载体pET32/Hc后进行融合蛋白的表达.对5′端引物进行修饰,最终进行N端修饰蛋白的表达.结果:扩增得到的BoNTB/Hc与已知序列同源性达99%,未得到天然序列的表达,获得了融合蛋白和N端修饰蛋白的表达.Western blot鉴定结果表明,融合蛋白和N端修饰蛋白都可以和特异性抗体发生反应.结论:获得了B型肉毒毒素重链C端基因的表达,为肉毒毒素相关研究奠定了基础.     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

肉毒毒素的实验室检测方法及检测技术的研究进展

正肉毒毒素是肉毒杆菌在生长繁殖过程中产生的神经外毒素,根据毒素抗原性的不同,分A~G 7个亚型[1]。人类肉毒毒素中毒主要由A、B、E、F型毒素引起,动物的肉毒毒素中毒由C、D型引起,G型很少引起中毒。天然肉毒毒素纯品是白色晶体粉末,无味、易溶于水、稳定性差、不耐热。天然肉毒毒素和血凝素、非毒素非血凝素、核酸构成前体毒素——毒素复合物。     

抑肽酶基因的克隆和表达

抑肽酶作为天然的非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，临床用途广泛。为实现抑肽酶的大量制备，按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成抑肽酶结构基因，克隆于PUC18的EcoRⅠ和PstⅠ位点，转入Top10大肠杆菌（recA)中，经测序证明序列正确，表达体系模拟抑肽酶的体内成熟过程，将其自身的13肽pro序列融合于抑肽酶的N端，并在其间插入胰蛋白酶识别位点，该融合蛋白在使用PET-11C载体表达时，产物以包涵体形式存在于大肠杆菌中，表达量占菌体总蛋白的30%以上，复性实验证明：该肽段不影响抑肽酶的正确折叠，还能帮助抑肽酶包涵体进行体外折叠。提高复性得率，复性后使用胰蛋白酶切割融合蛋白，可得天然构象的活性抑肽酶。     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及原核表达

目的构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（＋）-CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端氨基酸序列并据此设计引物,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增细胞毒素基因序列（CTXcDNA）。将CTXcDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（＋）中,双酶切图谱、PCR和DNA测序鉴定,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物,GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX;Western-blotting鉴定。结果成功合成CTXcDNA,并构建原核表达质粒pET42α（＋）/GST-CTX,在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的28.9%,Western-blotting证实纯化蛋白为重组CTX融合蛋白（rCTX）。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得rCTX具有眼镜蛇毒CTX的抗原性。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链结构类似多肽融合蛋白的制备

为了在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)与胰岛素B链(9-23)肽段结构类似多肽(Ins B(9-23))的融合蛋白,使用基因工程方法构建了CTB与Ins B(9-23)的融合基因CTB-Ins B-X若干,并将融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌株经乳糖诱导后,其表达产物经过12%SDS-PAGE分析表明该菌株可以包含体形式表达融合蛋白,并制备得到纯度较高的重组蛋白。该重组蛋白的包含体经过变性、复性后,可以在体外自组装成五聚体结构。GM1-ELISA分析结果表明,重组蛋白在体外可以与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合,表明该融合蛋白保持了CTB形成五聚体的生物活性。     

mIL-4-SA双功能融合蛋白的制备和活性测定

目的制备链亲和素标记的鼠白介素4(mIL-4-SA)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法通过RT-PCR克隆mIL-4基因,构建mIL-4-SA-pET21表达质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,对表达的融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)色谱柱纯化、透析复性。MTT法检测融合蛋白对C57小鼠胸腺细胞的增殖作用,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16F10细胞锚定修饰率。结果成功构建了mIL4-SA-pET21质粒,并在大肠杆菌中实现高效表达,表达量达菌体总蛋白质的35%,纯化后的mIL-4-SA融合蛋白纯度达95%,并具有双重活性,即mIL-4对C57小鼠胸腺细胞具有增殖作用和SA介导的高效结合至已生物素化的B16F10肿瘤细胞表面的功能(表面锚定修饰效率96.69%)。结论研制的mIL-4-SA融合蛋白具有双重活性,可为研制表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。     

F型肉毒毒素单克隆抗体的筛选及评价

研究以筛选得到中和抗体为目的,通过抗体制备的常用手段——杂交瘤技术进行,以F型肉毒毒素受体结合结构域FHc端作为单克隆抗体的筛选抗原。利用现有抗原FHc蛋白辅助佐剂对动物进行免疫,免疫结束后无菌环境中取动物脾细胞,与预先培养的SP2/0细胞融合后HAT选择性培养基筛选得到阳性杂交瘤细胞株,大量培养后通过体内诱生法制备单抗,纯化后对所得鼠源抗体各指标进行评价,结果测得该单抗亚型为IgG1,κ型、经过Protein G柱纯化后抗体纯度可达到98%以上、与FHc端结构域亲和力可达到5.2×10^-8 mol/L、轻重链基因调取后经Igblast tool分析得抗体可变区中轻链及重链CDR3区氨基酸序列为QHIRELTR、ARWLGDYAMDY,采用10倍半数致死量进行攻毒实验可得,该抗体中和效价在200 LD₅₀/mg,当抗体量达到50μg就可以实现完全保护。实验通过细胞融合的方式,在聚乙二醇的化学刺激下,筛得一株阳性杂交瘤细胞株,取细胞上清,以亲和力作为筛选指标,得到了一株针对F型肉毒毒素受体结合结构域FHc端的具有高亲和力和并同时具有中和效果的鼠...     

重组霍乱毒素B亚单位的高效表达、纯化及鉴定

本研究采用基因工程技术,构建一种重组霍乱毒素B亚单位（rCT-B）的高效表达/分泌系统。 将CT-B结构基因ctxB与修饰的ompA信号序列融合,然后根据鼠伤寒杆菌阿拉伯糖操纵子的调节信号克隆入M13噬菌体并感染大肠杆菌。将此大肠杆菌接种于含0.2％阿位伯糖的LB肉汤中培养,检测培养物中rCT-B含量并通过S-SepharoseFF柱进行纯化。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦、质谱分析等方法对rCT-B的特性进行研究。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白B胞外区基因片段的克隆、表达及初步鉴定

构建单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(HSV1gB)胞外区基因片段的重组原核表达质粒,并获得HSV1gB胞外区基因的表达.选用真核和原核细胞均偏爱的密码子,化学合成含信号肽序列的HSV1gB蛋白胞外区基因序列,用PCR方法扩增编码HSV1gB胞外区1～696 aa的基因,利用DNA重组技术将其定向插入到原核表达载体pGEX4T-2上,转化大肠杆菌TG1菌株,经IPTG诱导表达及SDS-PAGE鉴定分析.SDS-PAGE检测显示,表达的HSV1gB/GST 融合蛋白分子质量为96 ku.利用亲和层析方法,纯化获得了表达的目的蛋白.ELISA结果表明表达产物具有较好的抗原性和特异性.可溶性重组HSV1gB蛋白的表达成功为单纯疱疹病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础.     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定

目的在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

Use of Biophysical Characterization in Preformulation Development of a Heavy-Chain Fragment of Botulinum Serotype B: Evaluation of Suitable Purification Process Conditions

PURPOSE: The purpose of this study was to investigate the physicochemical and structural characteristics of recombinant botulinum serotype B (rBoNTB(Hc)) under various conditions and to use the information in evaluating suitable purification process conditions. METHODS: The solubility of rBoNTB(Hc) was evaluated at pH 4, 5, 6 7.5, 8, and 9. Secondary structure was evaluated using circular dichroism, and conformational stability was monitored using highsensitivity differential scanning calorimetry. Hydrophobic interaction chromatography, size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography (SEC-HPLC), sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), peptide mapping, and UV spectroscopy were used to monitor stability under the various conditions. RESULTS: The secondary structure of rBoNTB(Hc) consists predominantly of beta-sheets. Solubility of rBoNTB(Hc) was lowest at its pI and highest at low and high pH. In the presence of NaCl, however, solubility decreased with increase in pH. Conformational and chemical stability are improved below pH 7.5. In the presence of 150 mM NaCl at high pH, conformational and chemical stability of rBoNTB(Hc) are further decreased. The study suggests that the purification process should minimize exposure of rBoNTB(Hc) to high pH and salt conditions. CONCLUSIONS: Optimal stability of rBoNTB(Hc) is achieved at low pH. The biophysical and analytical studies provide us with an understanding of rBoNTB(Hc) stability behavior in solution and assists in developing efficient purification conditions.     

Functional EL-HN Fragment as a Potent Candidate Vaccine for the Prevention of Botulinum Neurotoxin Serotype E

Clostridium botulinum produces botulinum neurotoxin (BoNT), which is the most toxic known protein and the causative agent of human botulism. BoNTs have similar structures and functions, comprising three functional domains: catalytic domain (L), translocation domain (HN), and receptor-binding domain (Hc). In the present study, BoNT/E was selected as a model toxin to further explore the immunological significance of each domain. The EL-HN fragment (L and HN domains of BoNT/E) retained the enzymatic activity without in vivo neurotoxicity. Extensive investigations showed EL-HN functional fragment had the highest protective efficacy and contained some functional neutralizing epitopes. Further experiments demonstrated the EL-HN provided a superior protective effect compared with the EHc or EHc and EL-HN combination. Thus, the EL-HN played an important role in immune protection against BoNT/E and could provide an excellent platform for the design of botulinum vaccines and neutralizing antibodies. The EL-HN has the potential to replace EHc or toxoid as the optimal immunogen for the botulinum vaccine.     

可溶性CD40基因修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒活性的影响

目的探讨可溶性CD40-增强绿色荧光蛋白C(sCD40-EGFP)修饰树突状细胞(DC)对实验动物免疫功能的影响,为利用DC诱导供体特异性移植免疫耐受提供实验依据。方法应用基因工程技术构建CD40胞外区与EGFP重组载体质粒pEGFP-N1/sCD40,采用脂质体转染法,将其导入DC2.4细胞株。采用荧光分光光度计和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定转染质粒pEGFP-N1/sCD40的DC培养上清;将经未修饰DC细胞及sCD40-EGFP及空载体修饰DC经腹腔注射致敏Balb/c小鼠,取单个核细胞作为反应细胞,分别以不同组DC为刺激细胞,行混合淋巴细胞培养,采用MTS比色法检测细胞增殖,乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性。结果sCD40分子与EGFP融合基因载体构建成功,在树突状细胞中获得表达,并分泌至上清;sCD40-EGFP融合蛋白对不同组DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应均有明显的抑制作用,sCD40-EGFP基因修饰DC诱导不同DC致敏组小鼠淋巴细胞增殖反应均明显降低,sCD40-EGFP融合蛋白对各实验组淋巴细胞胞毒活性有显著的抑制作用,sCD40-EGFP基因修饰DC致敏组小鼠淋巴细胞胞毒活性较其余实验组明显降低。结论稳定表达sCD40-EGFP融合蛋自的DC致敏可显著降低同种小鼠淋巴细胞的增殖反应,并能诱导淋巴细胞对靶细胞的胞毒活性降低。     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.