实时荧光定量RT-PCR检测乳腺癌VEGF mRNA的表达

目的：建立实时荧光定量逆转录一多聚酶链反应（real—timequantitative,RT—PCR）检测乳腺癌患者肿瘤组织VEGFmRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学LsAB方法检测VEGF蛋白表达的相关性。方法：提取组织总RNA,逆转录成mRNA,采用实时荧光定量RT—PCR检测44例乳腺浸润性导管癌、25例癌旁正常小叶组织、13例乳腺良性疾病组织中VEGFmRNA表达;采用免疫组织化学LSAB法和彩色图像病理分析系统半定量检测其VEGF蛋白表达。结果：乳腺癌组织中VEGFmRNA表达水平显著高于癌旁和良性病组织（｜P〈0．001）,而后两者之间无明显差异（P〉0．05）;VEGF蛋白表达在癌组织,癌旁和良性病组中的分布特点与VEGFmRNA完全一致。结论;本研究所建立的用于检测人乳腺组织VEGFmRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化LSAB方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性,在乳腺癌的早期诊断和良恶性鉴别诊断中具有重要的参考价值。     

实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达

利用荧光TaqMan技术 (5′核酸外切酶活性 )和一种可以实时检测荧光信号的仪器 (ABIPrism 770 0序列检测系统 ) ,在PCR反应完全封闭的情况下可实时检测PCR扩增的动力学变化 ,能够对标本扩增过程中的起始拷贝数快速、准确地定量 ,极大地克服了原有PCR技术存在的不足 ,已逐步成为PCR更新换代的新技术[1 ,2 ] 。目前常规检测 β1 转化生长因子(TGF β1 )表达多采用竞争RT PCR及内源性参比基因RT PCR ,它们都属于PCR终点法检测 ,很难对起始模板数准确定量。我们利用实时荧光定量RT PCR技术建立了检测TGF β1 mRNA表达的方法。…     

实时荧光定量RT—PCR检测肺癌中PUMA mRNA的表达

目的 建立检测肺癌PUMA mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法,初步探讨PUMA mRNA表达水平与肺癌发生发展的关系.方法 以GAPDH作为内参照基因,应用实时荧光定量RT-PCR,检测PUMA mRNA在肺癌组织中的表达水平.结果 建立了应用实时荧光定量RT-PCR检测肺癌PUMA mRNA的方法.熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证实了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,40例肺癌患者的肿瘤组织、对应的癌旁组织、远癌组织和10例肺良性病变组织中均有PUMA tuRNA的表达,表达水平在肺癌与肺良性病变之间、肺癌各病理类型之间差异均无统计学意义(P>0.05).结论 应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR可以特异、准确、快速地分析不同肺组织中PUMA mRNA的表达差异.非小细胞肺癌的发生发展与PUMA mRNA的表达无明显相关性.     

实时荧光定量RT-PCR检测直肠癌术后引流液细胞角蛋白19mRNA的临床意义

目的探讨实时定量PCR技术检测直肠癌术后引流液中细胞角蛋白19（CK-19）mRNA表达的临床意义。方法采用实时定量RT-PCR的技术,检测59例直肠癌根治手术后和15例腹部良性病变术后腹腔引流液中CK-19mRNA的表达。分析直肠癌根治术后腹腔引流液中CK-19mRNA的表达及其与肿瘤侵及深度、腹腔淋巴结转移、肿瘤分化程度的关系。结果直肠癌患者术后腹腔引流液CK一19mRNA表达的阳性率为67．8％（40／59,CK．19mRNA〉4为阳性标准）,明显高于腹部良性病变患者。CKl9mRNA表达情况与浸润深度、淋巴结转移多少、组织学分化程度有关,组间差异具有统计学意义（X^2值分别为8．47、9．19、8．32,P〈0．05或P〈0．01）;结论而且CK19mRNA表达与病理级别具有相关性,淋巴结转移分级越高,直肠癌术后引流液中CK-19mRNA越高（r=0．674,P：0．021）;分化程度越低,术后引流液中CK-19mRNA表达越高（r=-0．741,P=0．014）。结论RT-PCR检测术后腹腔引流液中CK-19mRNA浓度提高直肠癌微转移诊断的敏感性;RT-PCR有助于判断直肠癌术后微转移,是指导术后治疗并评估预后的好方法。     

实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织中KLK4 mRNA表达

目的探讨KLK4基因在人乳腺癌组织中表达的临床意义。方法用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)的方法检测39例乳腺癌组织和25例正常组织中KLK4 mRNA的表达,以及mRNA表达量与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、CerbB-2及肿瘤的转移情况进行相关性分析。结果正常乳腺组织和癌组织KLK4 mRNA的相对表达水平分别为0.0120±0.0044和0.0272±0.0067,两者差异显著(P<0.01);乳腺癌组织中KLK4的相对表达水平在ER( )和ER(-)组分别为0.0269±0.0070和0.0276±0.0067;在PR( )和PR(-)组分别为0.0270±0.0065和0.0275±0.0081;在CerbB-2( )和CerbB-2(-)组分别为0.0270±0.0064和0.0301±0.0074;在肿瘤有、无转移组分别为0.0258±0.0061和0.0276±0.0066,各组间KLK4mRNA表达水平均无显著性差异(P>0.05)。结论在乳腺癌组织中KLK4 mRNA的表达水平显著高于正常乳腺组织,但在肿瘤是否转移,雌激素受体、孕激素受体及CerbB-2阳性和阴性组间无显著性差异。     

荧光定量PCR法检测食管癌外周血Survivin m—RNA的临床意义

目的探讨凋亡抑制基因Survivin在食管癌患者外周血中表达的临床意义。方法共93例食管良、恶性病变患者，采用荧光定量PCR法，检测外周血Survivin m-RNA，分别观察其在食管良性病变、原位癌及浸润癌患者外周血中的表达强度。结果Survivin m-RNA在食管良性病变、原位癌及浸润癌患者外周血中均呈渐进性高表达，并与病期有关。结论外周血中Survivin m-RNA表达强度与食管癌的发生、发展密切相关，实时荧光定量PCR法检测食管癌外周血中Survivin m-RNA，可方便食管癌的诊断及指导治疗。     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测外周血单个核细胞TRAIL-mRNA

目的 建立TaqMan实时荧光定量RT-PCR（rQ-RT-PCR）检测外周血单个核细胞（PBMC）中肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）mRNA含量的方法,探讨PBMC中TRAIL mRNA的检测价值.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,用RT-PCR扩增目的片段,实时检测产物的荧光强度,以标准品建立标准曲线,软件自动计算出待测样本中TRAIL mRNA含量,以TRAIL mRNA和β2M mRNA含量的对数比值进行TRAIL mRNA表达水平评价.结果 TRAIL mRNA含量线性范围为（2.9×10^3～2.9×10^9）copies/ml,批内和批间变异系数分别为9.5%和16.7%.30例健康献血员和58例慢性乙肝患者TRAIL mRNA与β2M mRNA浓度的对数比值的（x）±s分别为0.528±0.014和0.775±0.038,两组差异显著,P＜0.001.结论 FQ-RT-PCR检测TRAIL mRNA水平具有较好的灵敏度和重复性,适用于临床研究.     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

实时荧光定量RT-PCR技术检测siRNA对HBV复制的干扰效果

目的 运用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测小RNA分子（small interfering RNAs,siRNA）对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的抑制作用.方法 在HepG2.2.15细胞内导入筛选的三条特异抗HBV的siRNA分子,用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测干扰后HBV的mRNA表达水平.结果 导入特异siRNA分子的细胞中HBV的mRNA表达量明显降低.结论 实时荧光定量RT-PCR技术能准确可靠的检测mRNA的表达水平,对siRNA分子干扰效果的评价有很好的应用价值.     

套式荧光实时RT-PCR检测结直肠癌患者外周血中CRD-BP mRNA

目的　研究结直肠癌患者外周血中CRD BPmRNA的表达,探讨其作为结直肠癌标志物的可行性。方法　用套式荧光实时PCR对 64例结直肠癌患者、20例胃肠道良性疾病患者和 25例健康成人进行外周血CRD -BPmRNA的检测,并对阳性PCR产物进行克隆、测序。结果　结直癌患者中, 28(43 8% )例检测到CRD BPmRNA表达,在良性病和健康人均无表达,两组差异显著(χ2 =26. 493,P<0. 001)。CRD -BPmRNA的表达与结直肠癌的Dukes分期有显著相关性(χ2 =8. 195,P<0. 05)。结论　在结直肠癌患者的外周血中,能够检测到CRD- BPmRNA的表达,CRD- BPmRNA可作为外周血中结直肠癌细胞的肿瘤标志物用于临床诊断。     

实时荧光定量PCR测定食管癌VEGF-C和VEGFR-3基因表达

目的建立测定血管内皮生长因子-C(VEGF-C)mRNA和血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR),探讨其在食管癌组织及其癌旁组织中的表达水平。方法分别以自行构建和克隆的pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,用循环阈值(Ct)定量起始的模板,在荧光TaqMan方法的基础上建立了测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的实时FQ-RT-PCR,并分别测定了40例食管癌组织及其癌旁组织中VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的表达水平。结果VEGF-CmRNA和VEGFR-3 mRNA测定的线性范围均为103~108拷贝/μg总RNA;VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA高、低值的批内、批间变异系数(CV)在7.07%~12.49%之间。VEGF-C mRNA主要表达在癌组织中,而VEGFR-3mRNA在癌组织与癌旁组织中表达无差异;VEGF-C mRNA与VEGFR-3 mRNA在癌组织与癌旁组织中表达存在相关性;24例淋巴结转移食管癌患者癌组织及其癌旁组织VEGF-C mRNA和V...     

荧光定量RT-PCR检测AFP mRNA基因表达方法的建立

目的　建立荧光定量RT PCR检测检测AFPmRNA基因表达的方法。方法　提取肝癌细胞株HepG2 的总RNA ,进行RT PCR扩增AFPmRNA特异性片段 ,纯化PCR产物并与pMD 18 T载体连接 ,构建重组质粒。结果　重组的质粒经酶切和测序鉴定 ,目的片段已插入 pMD 18 T载体内。 结论　成功建立荧光定量RT PCR检测AFPmRNA基因表达的方法。     

实时定量RT-PCR监测慢性粒细胞白血病患者造血干细胞移植后bcr-abl mRNA水平

目的评价实时定量RT—PCR（Q—PCR）技术用于监测慢性粒细胞白血病（CML）患者异基因造血干细胞移植（HSCT）疗效的意义。方法采用基于TaqMan探针的Q—PCR技术检测112例CML患者HSCT后不同时间共316份骨髓标本bcr—abl mRNA的表达。bcr—abl mRNA水平以内参基因abl进行归一化。采用荧光原位杂交法（FISH）评估HSCT后是否达细胞遗传学完全缓解（CCyR）。结果Q-PCR实验可重复敏感度为5个拷贝。abl及bcr—abl基因CT值的批内差及批问差均〈2．0％。HSCT后1个月开始持续处于CCyR状态的101例患者，中位跟踪时问为12（6—60）个月的289份标本表现为HSCT后各时间段均有一定数量患者可检测出bcr-abl mRNA，总体上随着HSCT时间延长，中位水平逐渐降低。HSCT后1个月中位bcr—abl水平为0．035％（0～0．406％），较本室资料初治CML慢性期患者中位水平降低3个对数级，3个月时为0．006％（0～0．683％），6个月开始降至0％（0—0．225％），移植6个月后标本最高bcr—abl水平为0．068％。8例患者HSCT后未达CCyR或遗传学复发时bcr—abl水平为0．12％～13．45％，其中5例患者遗传学复发前的1份标本（复发前1—2个月）bcr—abl水平为0．09％-3．42％。9例持续CCyR患者bcr-abl水平曾经〉0．090％，但随后均下降至0。2例急变期患者HSCT后1．6和3个月内持续CCyR，但分别于1个月和1．5个月后进展为血液学复发，ber—abl水平亦从0及0．140％分别急剧增至46．900％和75．900％。结论Q—PCR技术精确、可靠，对CML患者HSCT后有必要定期系列监测ber—abl水平，以及时了解病情变化。对急变期患者需要更密切的监测。