金钱白花蛇及其混淆品高特异性PCR的鉴别

目的：建立一种实用、简便的金钱白花蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法：根据金钱白花蛇及常见混淆品线粒体Cyt b基因序列,设计一对专门用于中药材金钱白花蛇的鉴别引物HJL-1和HJH-1。用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场中购买的金钱白花蛇药材。结果：在67 ℃复性温度下进行PCR,正品金钱白花蛇均得到230 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。对市售金钱白花蛇药材随机选取18块进行PCR鉴别验证,其中正品14块,混淆品4块,检出率达100％。结论：设计的鉴别引物对正品金钱白花蛇有高度特异性。可用于市售金钱白花蛇药材的鉴定。PCR稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果不会有影响。     

快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用

为优化获得一种准确、快速、高效鉴别药典所载蛇类药材(乌梢蛇,金钱白花蛇,蕲蛇)真伪品的方法。该研究以蛇类药材经典PCR鉴定方法为基础,采用碱裂解法提取基因组总DNA,加入特异性PCR引物,采用两步法进行PCR扩增,从而对蛇类药材及其混淆品进行鉴别。通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇快速PCR反应程序。在PCR产物中加入SYBR Green I染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光。所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30~45 min完成,为蛇类药材现场快速鉴定提供技术支持。     

基于12S基因对中成药中药用乌梢蛇的分子鉴定研究

目的 建立一种适用于中成药中乌梢蛇药材掺伪问题的分子鉴别方法。方法 收集组方有乌梢蛇的中成药11种、乌梢蛇及其混伪品15种。对所有样品进行总基因组DNA提取,基于12S基因片段对乌梢蛇及其混伪品对比分析,根据差异位点设计乌梢蛇通用引物序列、特异引物序列以及荧光定量所用引物和探针,分别采用不同聚合酶链式反应(PCR)方法扩增乌梢蛇药材及中成药中乌梢蛇成分,优化反应体系并对方法进行耐受性和适应性的考察。结果 建立了乌梢蛇的特异性PCR技术,乌梢蛇正品均在200 bp附近处有一清晰条带,其他混伪品无条带。建立荧光定量PCR鉴别方法,适用于DNA含量低的中成药检测。结论 通过特异性引物PCR扩增可以有效鉴别乌梢蛇药材,通过荧光定量PCR检测法可以有效鉴别乌梢蛇药材及中成药中乌梢蛇的真伪问题。方法具有特异、快速、灵敏的特点,为乌梢蛇及中成药中乌梢蛇药材的真伪鉴别提供参考。     

位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究

目的:针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点,建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别方法.方法:根据鹿科鹿属种动物cytb全序列比对分析,设计1对能准确鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿茸的引物,在此基础上建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法,并对影响PCR结果的主要因素退火温度、Taq用量、循环次数以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化.结果:在方法学考察的基础上,在μL PCR反应体系,退火温度为65℃的条件下,能准确扩增出约323 bp大小的阳性DNA条带,经测序验证结果表明,系正品鹿茸原动物的Cytb基因序列片段,而伪品鹿茸未扩增出条带.结论:所建立的位点特异性PCR方法,能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来,具有较高的特异性、重复性,可广泛应用于鹿类药材的鉴别.     

快速PCR方法在山药真伪鉴别中的应用

目的:采用快速聚合酶链式反应(PCR)方法建立快速、准确、有效的山药药材真伪分子鉴定方法。方法:收集不同地区山药正品及其混伪品材料,对所有样品进行总DNA的提取,通过对山药及其混淆品DNA条形码rbc L片段进行同源对比分析,根据鉴别位点,设计中药山药的鉴别引物,引物序列为Sy89:5'-AAGGACGATGCTACCACATCGACAC-3',Sy90:5'-ATCCCAATAGGGGACGGCCA-3'。采用2步法进行PCR扩增,并对PCR反应体系和反应程序影响因素进行考察,从而对山药进行真伪鉴别。结果:通过对影响PCR退火温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行反应程序的优化,并对不同Mix进行考查,获得了山药快速特异性PCR反应程序。PCR扩增反应液为50μL,包括Premix TaqTM25μL,上、下游引物各1.5μL,DNA模板1.5μL,加无菌双蒸水至50μL。PCR扩增程序为98℃预变性1 min,98℃变性10 s,68℃复性15 s,30个循环,72℃后延伸30 s。以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物在250 bp附近处有一清晰条带,而混淆品无条带。结论:快速特异性PCR方法可以简单快速鉴别山药的真伪,为实现中药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。     

分子遗传标记技术在中药材鉴定中的应用

目前,用于中药材鉴定的分子标记技术主要有SCAR、RFLP、RAPD、PCR-RFLP、DNA测序和位点特异性鉴别PCR等。近5年来,通过这些分子标记技术的比较,我们发现位点特异性鉴别PCR技术以其简单、快速、准确、重现性好、成本低、抗污染等优点,将有十分广阔的应用前景。本文论述了位点特异性鉴别PCR技术以PCR反应为基础,通过对正品药材及其伪、混品的某些DNA片段的序列研究,找出正品药材的特异性位点,设计出只扩增正品药材的高度特异性的鉴别引物。用此引物对样品DNA进行一次PCR反应,经电泳检测便可准确鉴别样品的真伪。并对今后进一步开展此项工作提出了相应的建议。     

分子遗传标记技术在中药材鉴定中的应用

目前,用于中药材鉴定的分子标记技术主要有SCAR、RFLP、RAPD、PCR-RFLP、DNA测序和位点特异性鉴别PCR等。近5年来,通过这些分子标记技术的比较,我们发现位点特异性鉴别PCR技术以其简单、快速、准确、重现性好、成本低、抗污染等优点,将有十分广阔的应用前景。本文论述了位点特异性鉴别PCR技术以PCR反应为基础,通过对正品药材及其伪、混品的某些DNA片段的序列研究,找出正品药材的特异性位点,设计出只扩增正品药材的高度特异性的鉴别引物。用此引物对样品DNA进行一次PCR反应,经电泳检测便可准确鉴别样品的真伪。并对今后进一步开展此项工作提出了相应的建议。     

通关藤及其混淆品的RAPD鉴别研究

目的:应用RAPD技术鉴别通关藤及其混淆品,并分析同种不同产地通关藤基因同源性。方法:CTAB法提取7个不同产地的通关藤及其6种混淆品的DNA,以20条随机引物进行非特异扩增。结果:随机引物285(GGG AAC CCG T)可稳定扩增不同产地通关藤药材的DNA,随机引物E01(CCC AAG GTC C)可有效的鉴别通关藤及其混淆品。结论:RAPD法可准确鉴别正品通关藤及其混淆品,不同产地通关藤的基因具有同源性。     

动物乌梢蛇的鉴别

乌梢蛇为临床常用的祛风活络镇痉的动物类药材,随着野生动物保护的进一步加强,乌梢蛇的价格逐渐上涨,市场上出现了多种乌梢蛇的混淆品。为去伪存真,准确用药,本文将乌梢蛇正品及几种混淆品进行比较鉴别如下:乌梢蛇又名乌蛇,来源于游蛇科动物乌梢蛇Zaolys dhumnades(Cantor)除去内脏的干燥体乌     

藏药羌活鱼的COⅠ分子鉴定

对动物线粒体基因COⅠ进行PCR扩增及双向测序,得到羌活鱼及其混伪品无斑肥源和截趾虎的COⅠ基因序列。通过序列分析比对,根据序列差异设计特异性引物SJYW1,SJYW2,改变退火温度及循环数以得到特异性的反应条件。结果表明,当复性温度为54℃,25个循环时,正品羌活鱼在约350 bp处有明显扩增带,而无斑肥源和截趾虎没有扩增带。该实验具有较高的特异性、重复性,可用于羌活鱼的鉴别。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

柴胡及其常见伪品的DNA指纹鉴定

目的:建立柴胡及其伪品DNA指纹鉴别方法.方法:采用改良的CTAB法提取柴胡及常见伪品的干根基因组DNA,设计鉴别正品柴胡及其伪品的特异性引物,利用PCR扩增技术对正品柴胡及其伪品进行DNA指纹鉴定.结果:改良的CTAB法提取出大小为23 kb的基因组DNA条带,纯度在(1.71±0.11),且经特异引物PCR扩增,只有正品柴胡能扩增出173bp大小的片段,而伪品未能扩增出目的片段.结论:柴胡DNA具有特异性指纹特征,可作为市售柴胡的真伪鉴定依据.     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物,建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带,混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色,宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光,混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品,为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

特异性PCR鉴别蜈蚣及其混伪品

目的:蜈蚣是我国传统的中药材,具有良好的药用价值。目前市场上蜈蚣的混伪品日益增多,临床用药的安全性和有效性难以保证。该研究建立了一种蜈蚣基原物种的特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,以准确、简便的鉴别蜈蚣及其常见混伪品。方法:通过比较蜈蚣及其混伪品基原物种的COI基因序列差异,根据变异位点设计蜈蚣正品少棘巨蜈蚣的特异性鉴别引物WG-500.F和WG-500.R,采集蜈蚣原动物样本及药材样本,优化反应体系并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证。结果:少棘巨蜈蚣原动物样本及蜈蚣正品药材使用设计的蜈蚣鉴别引物经PCR扩增和凝胶电泳后出约500 bp的单一明亮条带,其他混伪品如多棘蜈蚣、模棘蜈蚣、哈氏蜈蚣、海南蜈蚣等均无条带出现。结论:PCR鉴别方法可准确鉴别蜈蚣原动物和药材的真伪,具有高度特异性,为中药材蜈蚣的真伪鉴别提供了良好的科学依据。该方法具有简单、直观等特点,有利于广泛的普及与应用,在中药材鉴定方面有着广阔的应用前景。     

应用位点特异性引物鉴定白花蛇舌草

目的:建立一种简便实用的白花蛇舌草药材的DNA分子鉴定方法.方法:收集目前市场上出现的白花蛇舌草及伪品共9种,分别提取总DNA,扩增rDNA ITS-2区序列,对比所有样品的该段核苷酸序列,并设计能专一性鉴别白花蛇舌草的位点特异性引物.结果:白花蛇舌草及其混淆品在ITS-2区的序列有显著差异.用位点特异性引物对所有样品DNA进行PCR扩增,只有白花蛇舌草有明显的约392 bp扩增产物,而其它8种植物在同等条件下无阳性产物.结论:所设计的鉴别引物对白花蛇舌草有高度的特异性.     

中药材龟甲细胞色素b基因特异性鉴定研究

 目的 建立一种实用、简便、准确的中药材龟甲DNA分子标记鉴定方法。方法 采用酚-三氯甲烷抽提法和盐析法提取龟甲mtDNA。从GenBank数据库中下载乌龟及常见伪品源动物mtDNA细胞色素b基因序列,经序列比较分析,设计特异性引物,并使用该引物对正品及其伪品mtDNA进行扩增并测序。结果 盐析法提取DNA的浓度高于酚-三氯甲烷抽提法,并且盐析法省时、经济。本实验所设计引物只能扩增正品龟甲mtDNA,测序结果与龟甲同源性100%。结论 盐析法是一套适合从龟甲中提取高质量DNA的方法,本实验所设计的引物具有高度特异性,可用于龟甲类药材的鉴定。     

基于板蓝根及其混伪品叶绿体基因组的mini-barcode开发及其定性能力的研究

[目的]基于板蓝根及其混伪品的叶绿体基因组序列开发mini-barcode并验证其鉴定能力,为板蓝根的质量控制和科学评价提供方法。[方法]从GenBank数据库中下载板蓝根及其混伪品所有已发表的叶绿体基因组序列,导入PhyloSuite v1.2.1软件提取其共有蛋白编码基因并分别对齐,后续使用DnaSP 6软件进行核苷酸多态性分析以筛选出候选DNA mini-barcode区域。通过Geneious软件多序列比对,筛选高变区用于mini-barcode开发。针对候选条形码区域设计引物。采用试剂盒法提取板蓝根药材总DNA分别利用通用ITS2引物和该实验设计引物进行聚合酶链式反应（PCR）和测序。[结果]基于叶绿体基因组的核苷酸多态性分析结果,选择accD基因作为候选mini-barcode开发区域并设计了扩增引物。通过遗传距离和测序数据分析,该分子标记能被成功扩增并实现鉴定。[结论]开发了用于鉴定板蓝根及其混伪品的mini-barcode,为实现DNA降解的板蓝根药材及含板蓝根的中药制剂等混合样本的真伪鉴别奠定基础。     

3种DNA分子标记法联合鉴别草珊瑚及其混伪品

目的采用18 S rRNA基因、ITS2序列、SCAR标记等3种DNA分子标记法鉴别草珊瑚,为其分子鉴定提供依据。方法通过PCR扩增、克隆测序后获得草珊瑚18 S rRNA基因序列,并进行Blast比对;通过PCR扩增、测序并注释后获得草珊瑚ITS2序列,从GenBank上收集混伪品和其他植物的ITS2序列,使用MEGA5.5软件,计算种内种间遗传距离,构建系统聚类树;通过RAPD法获得草珊瑚SCAR分子标记,克隆测序后,设计特异性引物扩增草珊瑚及其混伪品。结果获得的草珊瑚18 S rRNA基因长度为1 820 bp,Blast比对显示草珊瑚与金粟兰科同源性最高,同源性为99%,证明其为草珊瑚的18 S rRNA基因。获得的草珊瑚ITS2序列长度为500 bp,草珊瑚与其混伪品之间的遗传距离为0.190～0.219,混伪品之间的遗传距离为0～0.074,聚类分析显示草珊瑚聚为一支,混伪品聚为一支,与其他植物距离较远。获得草珊瑚的SCAR分子标记,用特异性引物扩增出现草珊瑚特异性产物,混伪品未出现特异性产物。结论 3种分子标记法联合可更有效地鉴别草珊瑚及其混伪品,从而建立一套新的鉴别草珊瑚与混伪品的方法,为其鉴别提供新的思路。     

基于物种特异性PCR方法的鸡内金真伪鉴别

目的:建立鉴别鸡内金及其常见伪品的物种特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,对全国中药材及饮片专项抽验任务中所抽取的鸡内金饮片进行真伪鉴别,评价市场上鸡内金的真伪情况。方法:根据鸡、鸭、鹅的12S序列差异,设计或优化物种特异性PCR鉴别引物,对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶种类等进行方法学考察和优化。使用优化的特异性PCR方法对鸡、鸭、鹅内金样品进行DNA分子鉴别。结果:在进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为55℃,循环次数为30次的条件下,当使用文中筛选得到的鸡物种特异性鉴别引物时,所测鸡内金饮片均检出约为273 bp的特异性扩增条带,混伪品鸭内金和鹅内金均无相应扩增条带;当使用鸭和鹅鉴别引物时,均未检出相应的扩增条带。结论:位点特异性PCR方法能够快速准确的鉴别出鸡内金真伪品,可用于全国中药材及饮片专项抽验任务中鸡内金的真伪鉴定,目前市场上用鸭内金和鹅内金充鸡内金现象较少,质量评价较好。