胞外青霉素酰化酶产生菌的选育

胞外青霉素酰化酶产生菌的选育ＳＥＬＥＣＴＩＯＮＯＦＨＩＧＨＹＩＥＬＤＳＴＲＡＩＮＰＲＯＤＵＣＩＮＧＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲＰＥＮＩＣＩＬＬＩＮＡＣＹＬＡＳＥ谢世兰王飞＊王庆敏段丽君（山东鲁抗医药股份有限公司研究所，济宁２７２１２１）ＸＩＥＳｈｉ－Ｌ...     

分离青霉素酰化酶产生菌的简易筛选法

Walton、Baker、Szewczuk等曾报道青霉素酰化酶产生菌的筛选方法。由于以上方法存在灵敏度低、实用性差、操作过程复杂以及仅适用于胞内酰化酶产生菌等问题,本文介绍一种简易快速既适于胞内酶又适于胞外酶产生菌的筛选方法。即改进的微生物学方法和酸量滴定法。微生物筛选法是将待测菌株接种到营养琼脂平皿上,培养过夜后以5ml含青霉素G5mg/ml的营养琼脂敷盖,再将生长在1%蛋白胨,0.5%氯化钠的液体培养基内生长18小时的粘质赛氏杆菌0.2ml涂于坚固的上     

青霉素酰化酶研究进展

青霉素酰化酶除了在医药工业上用于大规模生产β－内酰胺类抗生素中间体和半合成β－内酰胺类抗生素之外,还有其它的一些潜在应用;对青霉素酰化酶的研究一直吸引着各国科研人员的兴趣,近年来,用一些经典的和现代的技术手段,对青霉素酰化酶产生菌进行改良,通过理化诱变,使酶活力提高;通过定点突和化学修饰,将酶活性中心的丝氨酸变成半胱氨酸或含硒原子的半胱氨酸,使酶的合成活力相对于水解活力大幅提高,通过基因工程技术提高酶的表达水平,促进分泌或改进生产菌的缺陷,出现了介孔分子筛,二甘醇二甲基酯丙烯酸酯接枝尼龙共聚物等新的;固定化材料及酶膜反应器,多室固定化酶反应器,有望用于工业化生产。ββ     

青霉素酰化酶电极

用海藻酸钠-氯化钙包埋法制备青霉素酰化酶电极,电极涂液中海藻酸钠浓度为1％,酶量大于15U/100mg较好。经聚乙烯亚胺处理的电极的抗磷酸盐性能良好,测试在pH 7.05缓冲液中进行,加样搅拌平衡后,取停止搅拌5min后的pH读数,△pH-青霉素G浓度的线性范围为0～1.88mg/ml。温度和pH对pH响应值均有影响。     

青霉素酰化酶产生菌的分子育种及其产酶条件的研究

用EcoR1分别酶切质粒pACYC184和Ec108染色体,经连接、转化、筛选,得到7株克隆了青霉素酰化酶基因的转化体-C600(pPAHD1-7)。重组质粒pPAHD1在不同受体细胞内的酶活表达水平相差20倍。据此构建的工程菌其青霉素酰化酶活比出发菌株提高4～5倍。本文还对工程菌的产酶条件进行了研究。     

胞外青霉素酰化酶的研究

为了提供高比活力的并具有适当动力学参数的固定化酶用于青霉素的裂解,本文研究了Bacillus megaterium B-BM 39,Arthrobacter Vistcosus 13497及Arthro-bacter simplex ATCC 15799三个菌株胞外青霉素酰化酶的发酵、提取和酶学性质,并与目前国内使用的E.coli胞由青酶素酰化酶作了某些比较。为今后国内酶法生产6—APA工艺提供了一些参考依据。     

基因工程菌株产生的青霉素酰化酶的纯化及其性质

以构建的青霉素酰化酶基因工程菌(E.Coli 108/PPAHD 1)为材料,经硫酸铵沉淀、离子交换和制备电泳等手段将青霉素酰化酶的纯度提高了155倍,比活达17 u/mg,其凝胶电泳呈现单带。该酶有两个亚基,分子量分别为62300 d 和14900 d。并测定了该酶对温度及 pH 稳定范围、米氏常数等电点。     

胞外青霉素酰化酶产生菌的筛选及产酶条件

采用青霉素梯度琼脂平皿法，从土壤中快速筛选出３５株产胞外青霉素酰化酶的菌株，经复筛有５株酶活力较高，经鉴定均为芽胞杆菌，Ｂ３５－１７菌株酶活力最高．研究了Ｂ３５－１７菌株的胞外青霉素酰化酶产生条件，该菌株在最适产酶条件下，酶活力达２．６７ｕ／ｍＬ．在发酵培养基中添加０．２％的玉米浆能降低Ｆｅ２＋对酶合成的抑制作用．     

青霉素V酰化酶在生产6—APA中的潜力

目前发酵生产的青霉素G(Pen G)和青霉素V(Pen V)多半是用作生产β-内酰胺中间体6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙酰氧头孢烷酸(7-ADCA)的原料.有效、稳定的固定化青霉素酰化酶的开发,为合成具有不同抗菌性能的6-APA和7-ADCA衍生物创造了有利条件.现6-APA年产量约7500t,为此需消耗10~30t固定化青霉素酰化酶.     

固定化青霉素G酰化酶的初步研究

本文研究固定化青霉素G酰化酶的不同制备方法,比较了各种固定化青霉素G酰化酶的载体。实验表明:聚丙烯腈纤维和无机载体制成的固定化酶具有较高的酶比活力,而且表面积大,易于装柱,抗污染能力大,又能裂解高浓度青霉素 G 溶液生成6-APA。     

用CHITOSAN固定化青霉素酰化酶

本文报道以Chitosan为载体制备固定化青霉素酰化酶的研究结果。1.4％ Chitosan醋酸溶液先用12.5％戊二醛交联,洗涤,研磨,得颗粒。再用1.5％pH5.5和1.5％pH8.5多聚磷酸处理,得机械强度良好的载体。此载体先后经0.5％戊二醛和对甲苯磺酰氯双活化后,再与青霉素酰化酶偶联。所得固定化酶的活力达20.8u/g。固定化青霉素酰化酶的反应最适温度略高于游离酶,最适pH略低于游离酶;其Km值基本接近游离酶。固定化酶经反复使用,活力基本不变。     

固定化青霉素酰化酶反应器研究进展

介绍固定化青霉素酰化酶反应器的研究现状，将这类反应器分为搅拌釜反应器、柱式填充床反应器、中空纤维膜反应器以及电渗析耦合反应器，从工程角度分析了各类反应器的优缺点，并展望其今后的发展趋势。     

吸附法纯化青霉素酰化酶

目的纯化发酵液中的青霉素酰化酶。方法采用吸附纯化法。结果按 1 2 % (W /V)的比例将皂土加到含青霉素酰化酶的发酵上清液中 ,可将 98%的酶吸附 ,而同时吸附的杂蛋白质仅占发酵上清液总蛋白质的 14 5 %左右。吸附过程受pH影响较大 ,在 pH 6 5～ 7 5时 ,吸附效果最佳。使用不同种类的缓冲液洗涤酶 -皂土复合物 ,发现缓冲液的种类对酶的洗涤影响不大。使用含5 0 %以上的PEG和 8 0 %的NaCl的磷酸缓冲液可以将酶全部洗脱。结论此法可在常温下操作 ,酶活力收率较高 ,具有潜在的工业应用价值     

青霉素酰化酶的分离和纯化

采用渗透法冲击法提取大肠杆菌E.coli108青霉素酰化酶，得到了高比活的粗酶液，收率为93．3％，经硫酸铵分级沉淀、DEAE－Cellulose－52离子交换柱层析不得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条单带的酶，酶液比活为28．09u/mg，提纯了5．32倍，纯酶总收率为36．5％。     

生产青霉素酰化酶的一些改进

近年来,国内已将产生青霉素酰化酶的大肠杆菌制成固定化细胞并应用于裂解青霉素为6-APA和7-ADCA,通过选育得到了生产青霉素酰化酶的大肠杆菌高产菌株E Coli 2.543,我们将该菌株应用在2吨铁制罐内进行生产,生产中简化了发酵工艺路线,改进了酶活力测试方法,采用菌生长浊度,pH值、酶活力等参数并以菌浊度为主控制发酵周期,取得了较为满意的结果。 1.简化发酵工艺本工作所用的斜面、种子和发酵培养基均按文献配制,酶活力测定选用NIPAB法,在摇瓶试验基础上采用了最简化的发酵工艺路线:扁瓶斜面—→种子罐—→发酵     

青霉素酰化酶提取工艺的改进

青霉素酰化霉是由巨大芽孢杆菌经二级发酵，在生产过程中分泌到细胞体外的一种胞外酶。在工业生产中，我们对发酵液中酶的吸附和洗脱工艺进行改进，收到了明显的效果。     

青霉素G酰化酶的亚基重组

青霉素G酰化酶在半合成β-内酰胺类抗生素工业中催化关键反应。将来源于Esherichia coli的α亚基分别与Kluyvera citrophila,Providencia rettgeri,Alcaligenes faecalis的β亚基重组得到三种杂合酶,杂合酶表达量随野生型PGA同源性的减小而降低,E.coli和A.faecalis氨基酸序列的相同性低至41%,其杂合酶仍然具有水解3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸的活力。     

利用无机载体固定化青霉素酰化酶的研究

以无机材料６２０１型担体作载体,进行青霉素酰化酶固定化的研究。考察了ＡＰＴＳ和戊二醛浓度、给酶量以ｐＨ等因素对固定化酶酶活的影响。结果表明,以６２０１型担体为载体制备得到的固定化酶具有较高的酶活回收,达４２．８％;操作稳定性良好;用其连续水解３０批青霉素Ｇ的钾盐溶液,酶活未见明显下降;该固定化酶与游离酶相比,可在较宽的ｐＨ范围保持高酶活。     

吸附法纯化青霉素酰化酶的因素研究

按1．0％～1．2%（w／v）的比例将皂上加至青霉素酰化酶（产生菌株Bacillius subtilis BH97）的发酵上清液中，98％的青霉素酚化酶可被吸附，而吸附的蛋白质仅占发酵上清液的14．5％左右。吸附和洗脱过程受pH影响较大，在pH7．0～7．5时吸附效果最佳，而在pH6．5～7.5洗脱效果较好。不同种类的缓冲液洗涤酶-皂土复合物，受缓冲液影响不大。使用含5．0％以上的聚乙二醇和 8． 0％的 NaCl的磷酸缓冲液可将酶全部洗脱。此法简便易行，可在常温下操作，酶活力收率较高，可望具有一定的工业应用价值。