动力性三维细胞培养系统建立大鼠胰腺导管来源干细胞系的研究

目的 利用动力性三维细胞培养技术建立大鼠胰腺导管来源干细胞( PDSC)系.方法 以大鼠胰腺组织为材料,采用V型胶原酶原位消化分离大鼠胰腺组织,通过不连续密度梯度离心使胰腺导管细胞与胰岛细胞初步分离,采用动力性三维培养技术进行培养,获得原代PDSC,并进行扩增培养、连续传代和纯化,建立PDSC系.对原代分离的PDSC进行鉴定,包括形态学的鉴定及表达特性的鉴定.结果 通过胶原酶消化、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养,可分离培养出大鼠PDSC,并经过动力性三维培养,可以建立大鼠PDSC系.形态学方面,PDSC呈单个核;生长行为方面,PDSC在三维载体上沿纤维贴壁生长;表达特性方面,通过流式细胞仪分选结果显示,PDSC高表达CD29、CD73,CD90、CD105,不表达CD14、CD19、CD34、CD45,证实P DSC为间充质干细胞.结论 通过采用原位胶原酶消化法、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养系统,可分离培养出大鼠PDSC,成功建立PDSC细胞系.     

新生大鼠胰腺nestin阳性细胞的体外分离、培养和分化的研究

目的探索新生大鼠胰腺nestin阳性细胞体外分离、培养并使之形成类胰岛样细胞团的方法。方法应用胶原酶消化新生大鼠胰腺,将消化的组织碎片培养形成类胰岛样细胞团后传代。免疫荧光细胞化学法检测贴壁细胞胰岛素、胰高血糖素及nestin的表达。RT-PCR检测培养1周的贴壁细胞nestin及细胞角蛋白(CK19)的表达。结果在pH 7．6条件下培养24-36 h有部分细胞贴壁生长,改用pH 7．4无血清RPMI 1640培养液培养18-24 d可形成类胰岛样细胞团,传代后可有单层细胞生长。培养24～36 h的贴壁细胞nestin呈阳性,但胰岛素、胰高血糖素阴性,形成的类胰岛样细胞团传代后24 h胰岛素、胰高血糖素呈阳性。培养1周的单层细胞经RT-PCR扩增获得nestin 片段,但未获得CK19相应的片段。结论类胰岛样细胞团传代培养后可表达胰岛素、胰高血糖素; 胰腺nestin阳性细胞具有胰岛干细胞的特点。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验

目的 分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,检测其多向分化潜能.方法 采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况.结果 细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度＞98%.成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性.结论 密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞.     

大鼠胰腺干细胞自体移植及其对糖代谢影响的实验研究

目的明确成年鼠胰腺中有无胰腺干细胞存在,了解其可能的分化机制。方法切除大鼠大部分胰腺(90%)并消化、筛选出胰腺干细胞后回植入大鼠自体皮下,予不同处理因素诱导。观察大鼠血糖、血胰岛素浓度以及糖耐量试验的变化,并取移植物作常规染色和胰岛素、角蛋白19(CK-19)抗原的免疫组化检测。结果植入自体胰腺干细胞8周起,受体鼠血糖水平(P0.01)及血胰岛素水平(P0.05)与对照组比较均有明显差异;而对突发的糖刺激的耐受能力A组高于对照组,P0.05,B组则在给糖后180min表现出与对照组的差异,P0.05;术后10~12周受体小鼠移植物中可见与大鼠腹腔胰腺组织近似的乳白色内含细小颗粒结构,以及胰岛素染色及CK-19染色阳性细胞,而对照组均为发现类似结构及细胞。结论成体大鼠胰腺非内分泌组织中存在胰腺干细胞,经移植后能分化为胰岛素分泌细胞,并有改善受体鼠高血糖Υ态和糖耐量异常的作⒚。     

人脂肪组织来源干细胞体外培养条件的优化

目的探索人脂肪组织来源干细胞体外培养的最佳条件。方法人腹部皮下脂肪抽吸取材,采用胶原酶消化法获取细胞,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。比较了不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间和血清浓度对于人脂肪来源干细胞体外培养的不同效果。结果采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为1h时,2.0mg/ml组消化细胞总数最多,活细胞比值与其他组比较,差异有显著意义。在消化时间为2h时,消化细胞总数较1h各组均增加,同时,1.0、1.5和2.0mg/ml组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0mg/ml组和1.5mg/ml组最高。采用0、5%、10%、15%、20%五种不同血清浓度培养后发现,15%和20%组生长特性最佳,明显优于另外三组。结论对于人脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1.0mg/ml、消化时间2h、血清浓度15%是最佳的培养条件。     

人脂肪组织来源干细胞体外培养条件的优化

目的探索人脂肪组织来源干细胞体外培养的最佳条件。方法人腹部皮下脂肪抽吸取材,采用胶原酶消化法获取细胞,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。比较了不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间和血清浓度对于人脂肪来源干细胞体外培养的不同效果。结果采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为1h时,2.0mg/ml组消化细胞总数最多,活细胞比值与其他组比较,差异有显著意义。在消化时间为2h时,消化细胞总数较1h各组均增加,同时,1.0、1.5和2.0mg/ml组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0mg/ml组和1.5mg/ml组最高。采用0、5%、10%、15%、20%五种不同血清浓度培养后发现,15%和20%组生长特性最佳,明显优于另外三组。结论对于人脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1.0mg/ml、消化时间2h、血清浓度15%是最佳的培养条件。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养和分化的研究

目的探讨脊髓源性神经干细胞的培养方法和体外分化特性. 方法从孕龄15天的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清限定性培养基培养并进行干细胞体外分化,细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果. 结果胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,培养10天左右可获得干细胞球;用细胞免疫荧光化学法鉴定干细胞分化,可见其中含有神经元和星形胶质细胞. 结论无血清限定性培养基是脊髓源性神经干细胞的良好培养基;脊髓源性神经干细胞体外可诱导分化为神经元和神经胶质细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及初步鉴定

目的 探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,分析其部分表型特点,为细胞移植治疗中枢神经系统疾病奠定基础.方法 采用贴壁筛选法分离纯化大鼠MSCs,进行培养,传代扩增,免疫组化鉴定细胞是否表达具有干细胞特性的标记抗原-神经巢蛋白(nestin),并用流式细胞仪进行荧光检测初步鉴定.结果 分离后的MSCs出现增殖性生长,免疫组化显示巢蛋白(nestin)表达阳性,经流式细胞仪检测显示CD44,CD90阳性,CD45阴性.结论 在体外可培养出较大丰度大鼠骨髓间充质干细胞,而且此方法简单易行.     

三维微重力培养大鼠胰岛细胞的实验研究

目的　应用三维微重力组织培养对大鼠胰岛细胞的存活率及分泌功能进行研究。方法将大鼠胰岛细胞分离消化后分别进行二维普通培养 (Ⅰ组 )及三维微重力条件培养 (Ⅱ组 ) ,应用双硫腙 (DTZ)染色法 ,对胰岛细胞进行特异性染色鉴定 ;采用AO PI双染色法对两组培养 3d、7d、14d的胰岛细胞存活率进行检测 ;应用放射免疫法检测两种不同培养方法培养液中胰岛素分泌水平。结果　DTZ染色后胰岛呈桔红色 ,清晰可见。培养 7d和 14d时 ,Ⅱ组胰岛细胞存活率分别为(0 90 0 0± 0 0 10 7) %和 (0 80 38± 0 0 0 92 ) % ,均明显高于Ⅰ组 (P <0 0 1)。胰岛素测定结果表明 ,培养 7d时 ,Ⅱ组胰岛素水平为 (70 875± 0 31)mU/L ,Ⅰ组胰岛素水平为 (41 2 4 6± 0 35 )mU/L ,二者差异有显著意义 (P <0 0 1)。在培养的 14d、2 1d和 30d时 ,Ⅱ组胰岛素的分泌水平也均高于Ⅰ组(P <0 0 1)。结论　三维微重力培养组的胰岛细胞存活率及胰岛素分泌功能都优于二维普通培养组。     

大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞簇的研究

胰岛细胞来源有限，且受到伦理及免疫排斥等因素的制约，极大地限制了胰岛移植治疗糖尿病在临床上的广泛应用。成体干细胞能避开上述缺陷，且其可塑性为临床应用提供了可能。我们进行了将大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞簇的研究，现报告如下。     

Collecting Duct-Derived Cells Display Mesenchymal Stem Cell Properties and Retain Selective In Vitro and In Vivo Epithelial Capacity

We previously described a mesenchymal stem cell (MSC)-like population within the adult mouse kidney that displays long-term colony-forming efficiency, clonogenicity, immunosuppression, and panmesodermal potential. Although phenotypically similar to bone marrow (BM)-MSCs, kidney MSC–like cells display a distinct expression profile. FACS sorting from Hoxb7/enhanced green fluorescent protein (GFP) mice identified the collecting duct as a source of kidney MSC–like cells, with these cells undergoing an epithelial-to-mesenchymal transition to form clonogenic, long-term, self-renewing MSC-like cells. Notably, after extensive passage, kidney MSC–like cells selectively integrated into the aquaporin 2–positive medullary collecting duct when microinjected into the kidneys of neonatal mice. No epithelial integration was observed after injection of BM-MSCs. Indeed, kidney MSC–like cells retained a capacity to form epithelial structures in vitro and in vivo, and conditioned media from these cells supported epithelial repair in vitro. To investigate the origin of kidney MSC–like cells, we further examined Hoxb7⁺ fractions within the kidney across postnatal development, identifying a neonatal interstitial GFP^lo (Hoxb7^lo) population displaying an expression profile intermediate between epithelium and interstitium. Temporal analyses with Wnt4^GCE/+:R26^tdTomato/+ mice revealed evidence for the intercalation of a Wnt4-expressing interstitial population into the neonatal collecting duct, suggesting that such intercalation may represent a normal developmental mechanism giving rise to a distinct collecting duct subpopulation. These results extend previous observations of papillary stem cell activity and collecting duct plasticity and imply a role for such cells in collecting duct formation and, possibly, repair.     

成人胰腺干细胞转分化为胰岛细胞过程中的形态学观察

目的：观察成人胰腺干细胞转化化为胰岛过程中的形态学变化，以便更深入了解有关机制。方法：人胰腺组织经胶原酶消化后，用梯度离心法将胰腺外分泌细胞和胰岛分离，混于外分泌组织中的导管上皮细胞即具有转分化潜能的干细胞。在体外经CMRL1066及不含血清的DMEM／F12加多种营养因子的培养液中培养27d，在培养的不同时间点取细胞作PDX－1、CK－19等单抗的免疫组化染色。光镜和电镜观察不同时间点的形态学变化。结论：上述方法可获得大量以往在胰岛分离时丢弃的胰腺导管上皮细胞。经体外一定条件的培养后，其形态学变化过程为：导管上皮细胞迅速分裂增殖转变为有分化能力的干细胞继而转分化为胰岛细胞。结论：成人胰腺的导管上皮具有干细胞潜能，并可在体外转分化为大量具有内分泌功能的胰岛。用此方法获得大量的胰岛可能为克服胰岛移植的供体短缺提供一条新的途径。     

大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

目的：分离培养大鼠胰腺星状细胞,为体外研究胰腺纤维化提供细胞模型。方法：采用酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离胰腺星状细胞,通过倒置显微镜观察细胞形态,油红O染色和免疫细胞化学染色desmin,α-SMA进行细胞鉴定,并绘制传代后细胞生长曲线。结果：原代培养的大鼠胰腺星状细胞呈星形或梭形生长;原代胰腺星状细胞油红O染色胞浆均可见红色密集脂滴,直至传代后消失;原代胰腺星状细胞培养48 h后,desmin表达开始减弱,α-SMA表达开始增强;传代后desmin基本不表达,α-SMA阳性表达100%;传代后第3 d-5 d的胰腺星状细胞处于快速增殖阶段。结论：酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离培养大鼠胰腺星状细胞纯度高,重复性好,可以满足体外研究的需要。     

胰腺癌干细胞的研究进展

目的 总结有关胰腺癌干细胞的研究进展并明确今后的研究方向.方法 收集国内、外近年来有关胰腺癌干细胞的文献并进行综述.结果 胰腺癌恶性程度高,早期诊断困难,缺乏有效治疗手段.近年来的研究发现,胰腺癌中存在异质性细胞,这些细胞具有干细胞的性质,该细胞亚群在胰腺癌的发生、增殖、转移和耐药中发挥重要作用,通常利用细胞表面的特异标志物来鉴别胰腺癌干细胞.另外,研究还发现,胰腺癌干细胞内的一些维持自我更新和转移的信号通道表达异常.结论 针对干细胞的治疗是可行的,深入了解胰腺癌干细胞的生物学行为将为胰腺癌的诊断和治疗提供新的策略和手段.     

BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定

目的:建立小鼠精原干细胞长期培养体系,探讨精原干细胞体外增殖分化的关键因子。方法:收集出生4~6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良的两步消化法获得细胞悬液,种植到铺有明胶的培养皿中,分别于种植后1、5、24 h通过差速贴壁法去除体细胞,获得高度纯化的精原干细胞,种植到丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养液并补充15种添加成分;添加20 ng/ml大鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和200 ng/ml DDNF受体α1(GFRα1)促进精原干细胞增殖。分别采用免疫荧光染色和RT-PCR检测精原干细胞已知抗原和标志性基因的表达。结果:饲养层上培养3~4 d后精原干细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块状;小鼠精原干细胞能在该培养体系中稳定传代培养达3个月。免疫荧光共聚焦显微镜观察示Oct-4特异性表达在培养的精原干细胞核上;而GFRα1显著表达在培养的精原干细胞膜表面;RT-PCR也证实培养的精原干细胞表达Oct-4、GFRα1、Sox2和c-Ret等象征未分化精原细胞的标志基因。结论:BALB/c小鼠精原干细胞可在体外长期培养(3个月),该培养体系的建立将为研究精原干细胞增殖分化调控机制及精原干细胞移植治疗男性不育奠定基础。     

小鼠精原干细胞体外培养体系的建立

目的:建立小鼠精原干细胞体外扩增的培养体系。方法:取出生后2~6d的雄性ICR小鼠30只,脱颈法处死,切取睾丸后,采用两步酶消化法制成单细胞悬液,添加特定培养液,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞进行体外培养。培养后通过BrdU整合实验检测其增殖能力,并用碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光及RT-PCR技术对培养细胞进行鉴定。结果:小鼠精原干细胞在体外稳定增殖,所得克隆AP强阳性,标记物检测GFRα-1+/Oct-4+/VASA+/SCP3-,基因表达GFRα-1+/Oct-4+/SCP3-,证实所培养细胞为处于未分化状态的小鼠精原干细胞。结论:在本研究建立的培养体系下小鼠精原干细胞可稳定传代并保持未分化状态,为探索体外精子发生过程提供了良好的研究平台。     

Utilizing Quantitative Polymerase Chain Reaction to Evaluate Prostate Stem Cell Antigen as a Tumor Marker in Pancreatic Cancer

Background Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) may prove to be a sensitive technique by which to evaluate potential tumor markers in pancreatic cancer.Methods The prostate stem cell antigen (PSCA) gene was identified as a marker highly expressed in pancreatic adenocarcinoma and not normal pancreas. RNA from pancreatic and nonpancreatic cancer cell lines as well as tissue and blood from pancreatic cancer and control patients was reverse-transcribed and PSCA quantified by qPCR.Results Individual operator experience affects the results of qPCR, with significantly different copy numbers at experiment numbers 5, 15, and 40. Five of six pancreatic cell lines had PSCA/actin ratios 10-fold greater than nonpancreatic cancer lines. Mean PSCA expression in pancreatic tumor tissue was significantly higher (P < 0.05, Student’s t-test) than in the tissue of benign pancreatic processes. The close correlation of PSCA/actin copy number with number of tumor cells in the blood was demonstrated by regression analysis (r = 0.768, P = 0.0001). PSCA copy number was significantly higher in the blood of patients with metastatic pancreatic cancer than in that of normal patients (P < 0.05, Student’s t-test).Conclusions Such trends suggest that PSCA may prove to be a valuable pancreatic cancer tumor marker. More generally, the technique of qPCR is shown to provide a sensitive method of evaluating markers in cancer patients.This work was presented at the Society of Surgical Oncology Annual Meeting, Los Angeles, CA, March 2003.     

TNF-α增强树突状细胞诱导的抗胰腺癌免疫应答的实验研究

目的探讨体外扩增树突状细胞（DC）的方法，体外研究DC介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对小鼠胰腺癌的特异性杀伤作用。方法联合应用重组鼠源性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和IL-4体外诱导骨髓源性DC，与肿瘤细胞溶解物共培养制备DC疫苗；观察DC在负载抗原后体外诱导的主动特异性CTL对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果用GM—CSF和IL-4成功地在体外扩增了骨髓源性DC。TNF—α可诱导骨髓源性DC成熟，使其表达的CD54、主要组织相溶性复合物-Ⅱ、CD86等表面分子明显升高，并增强自分泌IL-12和抗原的递呈能力，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0.05）。未负载肿瘤细胞抗原的DC所冲击的T淋巴细胞不能有效地识别特定的靶细胞并产生杀伤作用，DC通过捕获并递呈坏死肿瘤细胞抗原才能诱发显著的主动特异性CTL，体外对胰腺癌细胞的杀伤效果非常显著（P〈0.01）。结论TNF—α可诱导DC的成熟，使DC的抗原递呈和自分泌IL-12的能力显著提高，DC递呈抗原后能诱发显著的主动特异性CTL。     

转壁反应器三维立体培养多样本骨髓间充质干细胞实验研究

目的探讨微载体三维立体培养自体骨髓间充质干细胞(MSC)方法。方法制备明胶多孔微载体,反应器内培养多样本自体MSC,比较其与普通培养的差异,研究生长曲线、粘附曲线、活力变化、糖消耗情况、蛋白合成以及碱性成纤维细胞生长因子影响。结果相转化法制备直径180～300um/孔径40～70um微载体。在合适的培养参数下,三维培养显著优于普通培养,细胞增殖迅速,糖消耗较快,蛋白产量无显著差异,碱性成纤维细胞生长因子可抑制三维培养的细胞传代老化。结论相转化法可有效制备多孔微载体,微载体三维立体培养自体MSC是获取组织工程种子细胞的有效方案。