动力性三维细胞培养系统建立大鼠胰腺导管来源干细胞系的研究

目的 利用动力性三维细胞培养技术建立大鼠胰腺导管来源干细胞( PDSC)系.方法 以大鼠胰腺组织为材料,采用V型胶原酶原位消化分离大鼠胰腺组织,通过不连续密度梯度离心使胰腺导管细胞与胰岛细胞初步分离,采用动力性三维培养技术进行培养,获得原代PDSC,并进行扩增培养、连续传代和纯化,建立PDSC系.对原代分离的PDSC进行鉴定,包括形态学的鉴定及表达特性的鉴定.结果 通过胶原酶消化、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养,可分离培养出大鼠PDSC,并经过动力性三维培养,可以建立大鼠PDSC系.形态学方面,PDSC呈单个核;生长行为方面,PDSC在三维载体上沿纤维贴壁生长;表达特性方面,通过流式细胞仪分选结果显示,PDSC高表达CD29、CD73,CD90、CD105,不表达CD14、CD19、CD34、CD45,证实P DSC为间充质干细胞.结论 通过采用原位胶原酶消化法、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养系统,可分离培养出大鼠PDSC,成功建立PDSC细胞系.     

乳腺癌肿瘤干细胞体外培养体系的建立

目的建立一种适合乳腺癌肿瘤干细胞体外培养的三维培养体系。方法根据不同的培养方法分为两组:二维细胞培养组,采用传统二维细胞培养方法培养乳腺癌MCF-7细胞;三维细胞培养组,将乳腺癌MCF-7细胞接种于三维胶原支架材料上,在摇床上动态培养5d,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察乳腺癌肿瘤细胞在胶原材料上的形态学特征。采用CCK-8细胞增殖检测的方法,比较三维培养组和二维培养组细胞增殖能力,通过流式细胞术检测两组乳腺癌肿瘤干细胞标志CD44~+/CD24~-/low的表达差异。结果光学显微镜下观察结果显示:二维培养组MCF-7细胞为单层生长平展的粘附生长,呈多边形、铺路石样的上皮细胞形态;三维培养组MCF-7来源的细胞再次二维培养后,细胞展现出三角形或者长梭形及较多细胞呈不规则形,部分细胞还伸展出长浸润性伪足。激光共聚焦显微镜观察显示,MCF-7细胞均匀地生长在三维支架材料上,局部放大后清晰可见长伪足,且细胞大小不均一,细胞形态多样。三维培养组细胞增殖速度与二维培养组相似。与二维培养组相比较,三维培养组CD44~+/CD24~-细胞比例显著增加,由38.9%增加至60.3%。结论基于三维胶原支架材料的三维培养体系能够有效维持乳腺癌肿瘤干细胞干性。     

三维培养状态下肌腱细胞骨架对细胞生物学行为的影响

目的 探讨肌腱细胞在三维支架上培养方式下细胞骨架的结构分布对细胞生物学行为的影响。方法将肌腱细胞与梯度降解肌腱支架材料(GDBM)体外复合三维培养，进行细胞骨架形态学观察、细胞增殖、细胞周期、细胞DNA倍体水平及肌腱细胞凋亡检测。结果GDBM组细胞第2天进入对数增长期，倍增时间为3．25d，而单纯培养对照组倍增时间为3．75d。与支架材料复合培养的肌腱细胞DNA指数为0．96，增殖指数比对照组高2．1％，其细凋亡率明显低于二维培养。提示肌腱细胞在三维支架上生长速度快，增殖能力强。结论三维培养状态下肌腱细胞在梯度降解肌腱支架材料上生长良好，梯度降解肌腱支架材料具有良好的生物相容性，可作为肌腱细胞的有效载体应用于组织工程化肌腱的构建。     

模拟微重力条件下新生大鼠心肌细胞三维培养体系的构建

目的研究模拟微重力条件下构建新生大鼠心肌细胞三维培养体系的方法. 方法分离新生大鼠原代心肌细胞,接种于聚乳酸(PLA)支架材料上,经搅拌瓶培养24小时后转入旋转式细胞培养系统,用倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜观察心肌细胞在支架上的生长情况,以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活性. 结果心肌细胞在PLA支架材料上贴壁、伸展,融合成片,保持持续的代谢活性,发现PLA-心肌细胞复合构造物的搏动.结论接种于PLA支架材料上的原代心肌细胞,在旋转式细胞培养系统的模拟微重力条件下,可以进行较理想的三维培养.     

大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

目的：分离培养大鼠胰腺星状细胞,为体外研究胰腺纤维化提供细胞模型。方法：采用酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离胰腺星状细胞,通过倒置显微镜观察细胞形态,油红O染色和免疫细胞化学染色desmin,α-SMA进行细胞鉴定,并绘制传代后细胞生长曲线。结果：原代培养的大鼠胰腺星状细胞呈星形或梭形生长;原代胰腺星状细胞油红O染色胞浆均可见红色密集脂滴,直至传代后消失;原代胰腺星状细胞培养48 h后,desmin表达开始减弱,α-SMA表达开始增强;传代后desmin基本不表达,α-SMA阳性表达100%;传代后第3 d-5 d的胰腺星状细胞处于快速增殖阶段。结论：酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离培养大鼠胰腺星状细胞纯度高,重复性好,可以满足体外研究的需要。     

胰腺癌细胞在二维和三维培养系统中的生长特性研究

目的探讨胰腺癌细胞在二维平面培养和三维培养(Ⅰ型胶原和细胞外基质胶)中的生长特性。方法将3株胰腺癌细胞株SW1990、PCT和ASPC-1分别采用上述3种培养方式进行培养,观察细胞生长形态。采用CCK-8法测定细胞生长曲线,采用乙醇固定碘化丙锭染色法检测细胞周期分布。结果细胞在二维平面培养系统中呈单层贴壁生长;在Ⅰ型胶原和细胞外基质胶中细胞形成多细胞球样体(multicellular spheroid,MCS),其生长速度较二维平面培养中的细胞慢。在二维平面培养中生长的SW1990、PCT和ASPC-1细胞的S期细胞的比例分别为(29.6±3.0)%、(33.6±2.1)%和(33.1±1.8)%,明显高于在Ⅰ型胶原中培养4 d和8 d形成的MCS的S期细胞比例〔(18.2±5.1)%、(14.5±3.2)%和(24.7±2.6)%〕,P<0.05,而G2/M期的细胞比例差异没有统计学意义(P>0.05)。在Ⅰ型胶原中培养4 d和8 d的SW1990和PCT细胞以及培养8 d的ASPC-1细胞的G0/G1期细胞比例明显高于其在二维平面培养中的细胞比例(P<0.05)。在Ⅰ型胶原中培养4 d的ASPC-1细胞和SW1990细胞的S期细胞比例明显高于其培养8 d的细胞比例(P<0.05)。结论不同的培养方式、培养介质对胰腺癌细胞的生长具有较大的影响。MCS三维培养系统能更好地模拟体内肿瘤细胞的生长状况。     

基于转谷氨酰胺酶交联明胶水凝胶的脂肪干细胞培养研究

目的构建转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,mTG)交联明胶水凝胶的脂肪干细胞(adiposederived stem cells,ADSCs)三维培养体系,观察ADSCs在该水凝胶中生长情况。方法取SD大鼠腹股沟皮下脂肪组织,采用胶原酶消化及离心分离获取ADSCs,并培养传代。定量称取明胶及mTG,分别置于PBS中溶解后,按照一定比例混匀制备mTG交联明胶水凝胶。取P3~P4代ADSCs分别于水凝胶表面二维培养及包埋于水凝胶中进行三维培养。培养期间,采用倒置相差显微镜观察ADSCs的生长形态,并进行HE染色和Masson染色,观察细胞在材料中的分布形态;采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察ADSCs在材料中存活状况;扫描电镜观察ADSCs在水凝胶表面黏附性;采用Alamar-Blue法检测ADSCs在水凝胶中增殖情况,以培养皿中常规培养细胞作为对照。结果二维培养观察示,ADSCs在水凝胶表面生长良好、细胞功能正常,贴壁良好。三维培养观察示,ADSCs在mTG交联明胶水凝胶中生长良好,呈三维立体形态,细胞向各方向伸展;细胞死活染色显示凋亡细胞非常少。各时间点三维培养的细胞数量显著低于常规培养细胞,比较差异有统计学意义(P0.05);但第8天开始,三维培养的细胞增殖明显加快,但常规培养细胞增殖开始减慢。结论基于mTG交联明胶水凝胶三维培养的ADSCs黏附性强,生长状况良好,成活率高。     

模拟微重力培养对大鼠甲状旁腺细胞形态及分泌功能的影响

目的模拟微重力培养甲状旁腺细胞,观察细胞形态及细胞分泌功能,以探讨甲状旁腺细胞更为优良的培养方法。方法雄性Wistar大鼠,37只,体质量150~200 g。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。手术切取甲状旁腺并经病理学证实。用胶原酶Ⅱ消化获得甲状旁腺细胞后,按培养条件不同分为普通培养组(单纯甲状旁腺细胞静置培养)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)支架培养组(甲状旁腺细胞接种在PGA支架上静置培养)、微重力培养组(甲状旁腺细胞和PGA支架在模拟微重力环境中共培养)3组。于细胞培养第1、3、5、7天时测量各组细胞培养液中甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)的浓度,于倒置相差显微镜下观察甲状旁腺细胞的生长形态、吖啶橙/碘化丙啶染色细胞并计算细胞存活率。结果普通培养组的细胞在第7天时大部分细胞形态良好,部分细胞团中心出现坏死灶。PGA支架培养组在第7天时支架上的细胞大部分沿PGA纤维纵轴方向向两极伸展,相邻支架被细胞外基质连接。微重力培养组的细胞在培养第7天时细胞仍呈圆形,相互聚集成团,并逐渐增大;培养液中的PTH浓度也明显高于PGA支架培养组和普通培养组(P0.05),且存活率也明显高于另外两组(P0.05)。结论模拟微重力培养甲状旁腺细胞,能使细胞保持良好形态,并显著提高细胞活力及存活率,从而为细胞输注移植治疗甲状旁腺功能减退症提供优良的供体细胞,PGA支架可以作为甲状旁腺细胞培养的良好载体。     

蚕丝在软骨细胞立体培养中的应用

目的 观察蚕丝对软骨细胞的吸附作用及蚕丝对软骨细胞形态和功能的影响。方法 从家蚕蚕茧中抽丝所得的蚕丝经胰蛋白酶消化和聚乳酸包埋,制成三维支架,软骨细胞与蚕丝三维支架进行复合培养,利用相差倒置显微镜、扫描电镜观察软骨细胞生长情况。结果 蚕丝三维支架上滴加软骨细胞悬液后,软骨细胞在不规则轻微漂动和缓慢下沉过程中粘附在蚕丝上,１～２天后完全贴壁。培养３天后软骨细胞开始分裂;５天后,细胞生长增殖十分活跃;     

一种改良大鼠肝细胞分离和原代培养技术

目的 探讨并改进大鼠肝细胞分离和培养技术.方法 Ⅲ型胶原预铺培养板,改良原位胶原酶两步灌流法分离肝细胞,适宜密度接种.含10%胎生血清的PuDMI 1640培养基培养;观察细胞产量、活率、贴壁和生长情况评价方法的可行性.结果 肝细胞分离时间明显缩短;胶原酶用量减少1/3;每鼠可获得(1.81±0.65)X 108个肝细胞;活率为(87.46±6.90)%;细胞接种4 h即可贴壁,可存活2～3周.结论 该法操作简便、经济,细胞产量和存活率高,贴壁和生长良好,可满足各种实验需求.     

大鼠急性胰腺炎胰腺细胞凋亡改变的实验研究的实验研究

目的 :了解急性胰腺炎 (AP)发病过程中胰腺腺泡细胞凋亡情况。方法 :将 48只SD大鼠随机分为两组 (胰腺炎组和假手术组 ) ,每组 2 4只。经十二直肠行胆胰管逆行加压注射 4%牛磺胆酸钠 ,诱导大鼠AP模型 ,于术后 3小时、6小时、12小时和 2 4小时分批处死动物 ,应用末端脱氧核苷酸转换酶 (TdT)介导的末端标记 (TUNEL)方法检测胰腺组织中的腺泡细胞凋亡。结果 :假手术组胰腺组织中存在极少量的凋亡细胞 ,数量相对恒定 ,与时间无关 ;胰腺炎组术后病变加重 ,胰腺凋亡细胞明显增多 ,3小时、6小时、12小时凋亡指数均明显高于假手术组 (P <0 .0 1) ,术后 2 4小时接近假手术组水平。结论 :急性胰腺炎胰腺存在腺泡细胞凋亡的改变 ,胰腺细胞凋亡可能是急性胰腺炎病变过程中的一个重要特征     

TOPK抑制剂HI-TOPK-032对胰腺神经内分泌肿瘤BON-1细胞体外恶性表型的影响

目的 杀伤性T细胞来源的蛋白激酶（T-lymphokine activated killer cell-originated protein kinase,TOPK）高表达与肿瘤增殖、凋亡、侵袭和转移密切相关。本研究旨在探讨使用TOPK抑制剂HI-TOPK-032对胰腺神经内分泌肿瘤细胞BON-1体外恶性表型的抑制作用。方法 通过蛋白免疫印迹实验检测人正常胰腺导管上皮细胞和不同胰腺肿瘤细胞系中TOPK的蛋白表达水平;CCK-8实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞增殖的影响;克隆形成实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞体外克隆形成的影响;Transwell实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞仪检测HI-TOPK-032对BON-1细胞周期的影响;Annexin V检测HI-TOPK-032对BON-1细胞凋亡和坏死的影响。结果 与正常胰腺导管上皮细胞相比,胰腺神经内分泌肿瘤细胞BON-1中TOPK蛋白表达显著上调;在体外实验中,与对照组相比,在含1、2.5、5 μmol/L浓度的HI-TOPK-032培养基中,BON-1细胞增殖能力依次减弱（22.2±8.2）%、（90.4±1.0）%、（89.7±0.9）%（P＜0.001）,克隆形成依次减少（19.1±2.1）%、（42.5±5.7）%、（87.0±5.6）%（P＜0.001）,迁移能力依次减弱（9.3±5.6）%、（70.5±4.0）%、（87.5±3.5）%（P＜0.01）,侵袭能力依次减弱（23.0±4.2）%、（60.7±5.4）%、（93.6±3.0）%（P＜0.01）;在含2.5、5 μmol/L浓度HI-TOPK-032培养基中,G0/G1期的BON-1细胞比例分别增加（12.2±2.0）%、（18.3±1.4）%（P＜0.001）,在5 μmol/L浓度时,S期的细胞比例减少（18.4±6.1）%（P＜0.01）,在2.5、5 μmol/L浓度时,G2/M期的细胞比例分别减少（17.6±8.6）%、（16.4±4.5）%（P＜0.001）;HI-TOPK-032促进BON-1细胞凋亡和坏死,凋亡依次增加（60.6±30.9）%、（79.5±27.5）%、（165.8±34.9）% （P＜0.05）,5 μmol/L浓度时,坏死显著增加,增加（385.8±67.3）%（P＜0.001）。结论 TOPK靶向抑制剂HI-TOPK-032显著抑制BON-1细胞的体外恶性表型,抑制效果呈剂量依赖式。HI-TOPK-032能调控BON-1细胞周期,促进凋亡和坏死。TOPK抑制剂HI-TOPK-032可能在胰腺神经内分泌肿瘤的靶向治疗中发挥重要作用。     

吞噬和细胞运动蛋白2对胰腺癌细胞趋化性和转移能力的影响

目的:观察吞噬和细胞运动蛋白2(ELMO2)对胰腺癌细胞株人源胰腺癌细胞系-1(PANC-1)的趋化运动能力、细胞黏附能力和侵袭能力的影响,探讨其作用机制。方法:2018年9月至2019年7月应用小干扰RNA技术对PANC-1中ELMO2蛋白进行敲减。采用配对设计方法,分为ELMO2蛋白敲减组、阴性敲减链对照组和空白对...     

臭椿酮抑制ENST00000441270/miR-149轴影响结直肠癌细胞增殖和凋亡的实验研究

目的探讨臭椿酮对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法根据检测结果实施分组,采用低(0.2μmol/L)、中(0.4μmol/L)、高剂量(0.6μmol/L)的臭椿酮干预结直肠癌SW1116细胞24 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,集落形成实验检测克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ENST00000441270和微小RNA-149(miR-149)的表达水平。转染ENST00000441270小干扰RNA(si-ENST00000441270)至SW1116细胞,采用上述方法检测干扰ENST00000441270表达对SW1116细胞活力、克隆形成以及凋亡的影响。双荧光素酶报告基因实验验证ENST00000441270与miR-149之间靶向关系。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果臭椿酮低剂量组SW1116细胞的活力[(0.84±0.05)比(0.84±0.05),t=0.529,P>0.05]、克隆形成数[(110.00±3.56)个比(111.33±3.86)个,t=0.499,P>0.05]、凋亡率[(7.56±0.80)%比(7.35±0.63)%,t=0.307,P>0.05]、ENST00000441270[(0.98±0.06)比(0.99±0.06),t=0.238,P>0.05]和miR-149[(1.01±0.07)比(0.99±0.07),t=0.303,P>0.05]表达与对照组比较,差异均无统计学意义。臭椿酮中、高剂量组SW1116细胞的活力(0.63±0.04、0.40±0.03比0.84±0.05,t=7.667、12.667,P<0.05]、克隆形成数[(85.67±2.87)个、(58.33±2.62)个比(111.33±3.86)个,t=9.487、24.666,P<0.05]、ENST00000441270表达[(0.69±0.05)、(0.41±0.03)比(0.99±0.06),t=7.138、13.799,P<0.05]低于对照组,差异均有统计学意义,细胞凋亡率[(12.61±0.91)%、(21.66±0.97)%比(7.35±0.63)%,t=7.715、12.036,P<0.05]、miR-149表达[(1.48±0.08)、(1.92±0.10)比(0.99±0.07),t=7.415、14.074,P<0.05]高于对照组,差异均有统计学意义。si-ENST00000441270组SW1116细胞活力[(0.35±0.02)比(0.88±0.05),t=17.047,P<0.05]、克隆形成数[(49.67±2.87)个比(112.67±3.40)个,t=24.525,P<0.05]低于阴性对照(si-NC)组,细胞凋亡率[(22.62±0.82)%比(7.58±0.65)%,t=24.896,P<0.05]高于si-NC组,差异均有统计学意义。miR-149是ENST00000441270的靶基因。结论0.4、0.6μmol/L的臭椿酮能够抑制结直肠癌细胞SW1116增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制ENST00000441270/miR-149分子轴有关。     

高压氧下调低氧诱导因子对急性胰腺炎的影响

目的 观察高压氧(HBO)抑制低氧诱导因子(HIF)活化对急性胰腺炎(AP)的影响.方法 40只Wistar大鼠随机分为假手术组、AP组、吸氧组和HBO组,每组10只.造模后4 h,吸氧组和HBO组大鼠分别接受常压下吸氧治疗和HBO治疗90 min;造模后6 h检测大鼠体内氧代谢水平;以免疫组织化学、激光共聚焦显微镜和Western blot法分析胰腺组织中HIF活化及血管内皮生长因子(VEGF)表达情况,检测胰腺组织髓过氧化物酶(MPO)含量和主要脏器干湿重比,以血清TNF-α和胰腺组织病理学评分评估病情.结果 免疫组织化学证实,AP组、吸氧组和HBO组腺泡细胞及中性粒细胞内HIF活化进入细胞核,并伴有VEGF高表达;与AP组[PaO_2:(86.6±5.6)nnn Hg(1 mm Hg=0.133 kPa);SaO_2:87.7%±1.8%]和吸氧组[PaO_2:(86.6±5.6)mm Hg;SaO_2:91.2%4±2.5%]比较,HBO组[PaO_2:(369.1±67.6)mm Hg;SaO_2:99.6%±0.7%]大鼠体内氧代谢水平升高(P<0,05);胰腺组织中HIF、VEGF和MPO含量减少,胰腺及胰外脏器水肿减轻,血清TNF-α和胰腺组织病理学评分降低(P<0.05).结论 HIF可促进AP炎症反应,HBO可以通过抑制HIF活化改善AP病情.     

Sonographic features of liver metastases from pancreatic glucagonoma and acinar cell carcinoma

The previously unreported ultrasonographic (US) features of liver metastases of pancreatic glucagonoma and of pancreatic acinar cell carcinoma are described. They present as complex masses with hyperechoic solid component, containing echo-free cystic areas; these sonographic features markedly differ from the echo-poor US pattern of the much more common metastases of pancreatic ductal carcinoma. Survival from diagnosis of liver metastases was 45 months in the patient with pancreatic glucagonoma and 23 months in the patient with acinar cell carcinoma. These survivals were much longer than the expected survival of patients with pancreatic ductal carcinoma metastatic to the liver. The US finding of highly reflective lesions in the liver, containing echo-free cystic areas, should alert one that the primary pancreatic tumor has a histotype different from ductal carcinoma. Such US findings could affect the decision to resect the pancreatic tumor and its liver metastases, if histology confirms a malignancy less aggressive than ductal carcinoma.     

软骨寡聚基质蛋白在慢性胰腺炎损伤中退变腺泡细胞内的表达

目的 研究正常胰腺、慢性胰腺炎与胰腺癌组织中软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)mRNA和蛋白表达水平的差异,揭示COMP在慢性胰腺炎样损伤中的意义。方法 采用Northern印迹法、Western印迹法、原位杂交法与免疫组化方法对14例慢性胰腺炎、14例胰腺癌及15例正常胰腺组织进行分析。结果 在慢性胰腺炎组织中和胰腺癌组织中类似慢性胰腺炎损伤的退变腺泡细胞胞浆内,存在高水平的COMP mRNA信号与免疫反应;而在胰腺癌细胞、正常胰腺组织的导管细胞与胰岛细胞的胞浆内,COMP mRNA信号与免疫反应微弱或缺如。结论 COMP在慢性胰腺炎及胰腺癌中类似慢性胰腺炎损伤的退变腺泡细胞内高表达,可能与慢性胰腺炎中腺泡细胞功能异常有关。     

体外诱导糖尿病鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究

目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力.方法 利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞,体外扩增3代,倒置显微镜观察细胞生长及形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达.取扩增第3代的BMSCs,分为2组,诱导组加入诱导培养剂[含10％胎牛血清、10μg/L血管内皮生长因子(VEGF)、2μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的M199培养基]中诱导分化,对照组则不加任何细胞因子.2周后行细胞形态学观察,免疫细胞化学法检测VEGF受体(VEGFR)-2表达,流式细胞仪测定CD34表达量,紫外线分光光度法测定一氧化碳(NO)含量,电镜观测胞质WeibelPalade小体.结果 STZ腹腔注射可诱导糖尿病大鼠模型.流式细胞仪显示第3代BMSCs表达表面抗原:CD44和CD90阳性细胞表达率分别为(97.8±0.9)％和(96.8±1.4)％,而CD11 b/c和CD34阳性细胞表达率分别为(13.2±0.6)％和(1.2±0.5)％.诱导组大部分细胞形态变化不明显,呈长梭形、杆状、多角形,诱导组VEGFR-2、CD34阳性表达率分别为(97.1±1.0)％和(65.0±3.9)％,而对照组则为(7.0±1.0)％和(0.9±0.3)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);诱导组胞外NO含量(94.14±3.25) μmol/L亦明显高于对照组(70.37±2.10) μmol/L(P ＜0.05);电镜两组均未观察到胞质Weibel Palade小体.结论 经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法可从骨髓中提纯BMSCs.糖尿病鼠BMSCs可在体外诱导向血管内皮样细胞方向分化,BMSCs有望作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的种子细胞.     

beta-cell neogenesis during prolonged hyperglycemia in rats

beta-cell neogenesis from ductal precursors, and possibly from other pancreatic cell types, contributes to the expansion of beta-cell mass during development and after diabetogenic insults in rodents. Using a mathematical model-based analysis of beta-cell mass, replication, and size, we recently demonstrated that neogenesis is also quantitatively important to the expansion of beta-cell mass during prolonged hyperglycemia. In the present study, we examined the morphological appearance of neogenic focal areas, duct cell replication, and beta-cell cluster size distribution in male Sprague Dawley rats infused with either saline or 50% glucose (2 ml/h) for 0, 1, 2, 3, 4, 5, or 6 days. Pancreatic tissue characterized by a high density of small duct-like structures, previously described as neogenic focal areas, were present in glucose-infused rats after 2, 3, or 4 days of infusion. The cross-sectional area of the pancreas characterized as focal tissue peaked after 3 days of infusion at 2.9 +/- 0.8%. In contrast to the partial pancreatectomy model of beta-cell regeneration, duct cell replication was not increased before or during focal area formation. However, the replication rate of cells in the duct-like structures of the focal areas was twofold greater than in cells of the common pancreatic duct and 15- to 40-fold greater than in cells of small, medium, and large ducts. Duct-cell replication was significantly reduced in small, medium, and large ducts of glucose as compared to saline-infused rats (0.21 +/- 0.02 vs. 0.48 +/- 0.04%; P < 0.03). Duct-associated beta-cell mass was not different in glucose- and saline-infused rats (P = 0.78), whereas the number of acinar-associated single beta -cells increased by 70% after 3 and 4 days of glucose infusion. In addition to small duct-like structures, focal areas had considerable T-cell infiltration (151 +/- 30 T-cells/ mm(2)). There was also an increase in T-cell infiltration in acinar tissue of glucose as compared to saline-infused rats (0.43 +/- 0.11 vs. 0.03 +/- 0. 01 T-cells/mm(2); P < 0.0001). In conclusion, these data suggest that neogenic focal areas in these glucose-infused rats do not arise from replication and differentiation of ductal progenitor cells. Rather, acinar cell transdifferentiation into beta-cells and acinar cell dedifferentiation into neogenic focal areas lead to new beta-cell formation during prolonged hyperglycemia.