鼻咽癌组织中EBV—BARFO基因序列的测定

目的：EB病毒（Epsterin-Barr virus,EBV)存在的变异影响到其生物学功能（如LMP1基因）。 BanHI A 区右向框0（BamHI Arightward fram0,BARF0)是在鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)病人中检出率很高的一个EB病毒基因,对其 变异性的研究尚未报道,本研究是为了广东鼻咽癌组织中EBV－BARF0基因的序列及其变异。方法：应用PCR技术从20例鼻咽癌组织中,扩增EBV基因BARF0,并对它们的序列进行测定。 结果：与标准株B95－8相比,鼻咽癌纺织品 EBV－BARF0均是4个位点发生空变：160473（G→T）、160701(C→ A)、160707(C→T）、160701（C→A）、160707（G→C）,并导致相应的氨基酸的改变 ：2（A→Ser)、26（Leu→Phe)、78（Arg→Phe)、78（Arg→Ser)、80（Ala→Pao)。结论：由于EBV的BARF0基因在鼻咽癌细胞株及检组织中100％表达,在淋巴瘤组织及淋巴瘤细胞株中表达较低或不表达,本研究首次报道鼻咽癌组织中EBV－BARF0的序列分析,与B95－8相比存在变异,并导致了蛋白质的一级结构的改变,推测该基因 很可能在鼻咽癌变过程中起着重要的作用。     

EB病毒编码的BARF1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用

背景与目的:EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)的BamHⅠA区域的早期基因BARF1能使猴肾上皮细胞永生化,使人淋巴细胞和呲类动物的成纤维细胞发生恶性转化,但有关该基因在人上皮细胞肿瘤发生发展中的作用未见报道。本研究的目的是观察EBV-BARF1基因对人上皮细胞生长特性的影响及能否使之发生恶性转化。方法:构建真核重组表达载体pcDNA3-BARF1,转染人支气管上皮细胞(HBE),建立稳定表达BARF1基因的HBE细胞株;观察细胞生长状况、生长速度、在软琼脂中集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果:EBV-BARF1基因转染细胞生长旺盛,失去接触抑制能力,生长速度增快,并在裸鼠体内成瘤。结论:EBV的早期基因BARF1作为病毒的癌基因,在支气管上皮细胞的恶性转化中可能起着重要作用。     

EB病毒基因BARF1在鼻咽癌细胞中的表达及意义

目的：探讨EB(Epstein—Barr)病毒新基因BARF1(BamHI A rightward open reading frame1)在人鼻咽癌组织中的表达及意义，为深入阐明EB病毒致癌机制提供实验依据。方法：提取RNA后，采用RT—PCR方法扩增标本中的EBNA1(EB virus associated nuclear antigen 1)和BARF1 mRNA，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳观察并照相。结果：11例RNA合格的标本均表达EBNA1，提示病例均为EB病毒阳性病例；其中9例表达BARF1，占82％：而且9例中的7例为强阳性。结论：EB病毒新基因BARF1 mRNA在鼻咽癌细胞中高表达，这提示除了已经明确的潜伏性膜蛋白1(LMP1)以外，BARF1可能在鼻咽癌细胞恶性增殖中发挥重要作用，具体机制有待深入研究。     

鼻咽癌组织中DNA 聚合酶β基因的突变

 目的 研究鼻咽癌中是否存在DNA聚合酶β（DNA polymerasβ，polβ）的突变及变异情况。方法 采用RT-PCR法（逆转录-DNA聚合酶链反应）、PCR-SSCP（聚合酶链-单链构象多态性分析）、DNA序列分析法对26例鼻咽癌组织进行polβ基因突变研究。结果 鼻咽癌组织中存在polβ基因突变，且基因突变率与癌组织的病理分级有关，高分化（G1）、中度分化（G2）、低分化及未分化（G3）鼻咽癌组织中polβ基因突变率分别为12.5％（2／16）、21．4％（3／14）、80％（8／10）。G1与G2比较，差异无统计学意义（P〉0．01），G1与G3、G2与G3比较，差异均有统计学意义（P〈0．005）。测序结果表明，polβ基因的第454位核苷酸由T变为C，其氨基酸变异为第114位氨基酸由Phe变为Ser；第466位核苷酸由G变为A，其氨基酸变异为第118位氨基酸由Gly变为Glu；第148位核苷酸由A变为G，其氨基酸变异为第28位氨基酸由Asn变为Ser。结论 发现在鼻咽癌组织中存在多种形式的polβ突变，导致氨基酸序列、空间结构的改变，可能与鼻咽癌的发生、发展相关。     

胃癌组织中EB病毒的检测及其增殖期基因的表达

目的；探讨EB病毒(Epsteirt-Barr virus．EBV)感染与胃癌发生的关系及其增殖期基因在EBV阳性胃癌发生中的作用。方法：应用聚合酶链反应（PCR）-Southern杂交检测185例胃瘟组织和相应癌旁组织中特异性EBVDNA片段．PER阳性标本用原位杂交(ISH)技术检测石蜡切片组织中EBV犏码小RNA1(EBER1）的表达．以确定EBV阳性胃癌一再应用RT-PCR和Southern杂交技术检测EBV增殖期基因(即刻早期基困BZLF1、BRLF1，早期基因BARF1、BHRF1．晚期基冈BcLF1、BLLF1)的表达．结果：13例胃癌组织EBV阳性(7．03％)，癌旁组织未检测到EBV感染．胃癌和癌旁组织中EBV阳性纺有显著性差异(X^2=11.0769．P=0．0009)。EBV阳性和阴性胃癌在年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发生部位的差别均无显著性(P=0．973，0．141，0．259，0．586，0．062)．但性别之间的差异有显著性，男性EBV阳性率高于女性（X^2=52317．P=0．021)。增殖期基因中即刻早期基因BZLF1有6例表达阳性．而BRLF1均为阴性；早期基因中有6铡BARF1表达阳性．2例BHRF1表达阳性；晚期基因BcLF1有7倒表达阳性．而BLLF1均为阴性。结论：EBV感染与胃癌的发生有一定的相关性．部分EBV阳性胃癌组织中存在EBV增殖性感染．早期基因BARF1和BHRF1在EBV阳性胃癌发生过程中可能有重要作用。     

EB病毒相关胃癌组织中病毒基因的表达

背景与目的：EB病毒(Epstein—Barr virus,EBV)与多种恶性肿瘤的发生有关,在鼻咽癌及淋巴瘤等组织中EBV的存在形式和表达已有报道,研究表明不同肿瘤组织中EBV的存在形式和表达不同,在胃癌组织中EBV某些基因尤其是裂解性基因的表达情况报道较少。为明确胃癌组织中EBV潜伏性基因和裂解性基因的表达情况,本研究从mRNA水平检测胃癌组织中EBV潜伏感染和裂解感染相关基因的表达,从分子水平探讨EBV编码基因与胃癌发生发展的关系。方法：应用PCR—Southern杂交检测185例胃癌及其相应癌旁组织中特异性EBVDNA片段,进一步用原位杂交(ISH)技术检测PCR阳性标本EBV编码小RNA1(EBERl)的表达,癌细胞EBERl阳性者确定为EBV相关胃癌(EBV—associated gastric carcinoma,EBVaGC)。采用RT-PCR和Southern杂交技术检测EBVaGCs组织中EBV核抗原(EBNAs)基因转录启动子(Qp、Cp和Wp)、潜伏性基因(EBNA1、EBNA2基因,潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A和LMP2B基因)和裂解性基因(即刻早期基因BZLF1和BRLF1,早期基因BARF1和BHRF1,晚期基因BcLF1和BLLF1)的表达。结果：185例胃癌标本EBV阳性率为7．03％(13／185),癌旁组织均为阴性。13例EBVaGCs组织中均检测到启动子Qp mRNA,而Wp和Cp mRNA则为阴性。潜伏性基因中EBNA1 mRNA均阳性(13／13),而EBNA2、LMP1和LMP2B均未见表达,5例标本(5／13)检测到LMP2A mRNA。裂解性基因中BcLF1有7例(7／13)表达阳性,2例(2／13)BHRF1表达阳性,6例标本(6／13)检测到BZLF1 mRNA,BARF1亦有6例(6／13)表达阳性,而BRLF1和BLLF1mRNA均为阴性。结论：EBVaGC中EBV潜伏类型为Ⅰ型或介于Ⅰ和Ⅱ型之间的独特类型;EBVaGC组织中部分裂解性基因表达阳性,部分胃癌存在BARF1和BHRF1表达,其在胃癌中所起的作用有待进一步研究。     

鼻咽癌细胞亚株不同成瘤与转移潜能的分子机制

背景与目的：我们已从鼻咽癌细胞株SUNE－1的克隆株中筛选出3个具有不同生物学特性的细胞亚株：5－8F（高成瘤,高转移）,6－10B（成瘤,不转移）和13－9B（不成瘤）;在本研究中,我们从病毒和遗传两方面探讨鼻咽癌细胞株SUNE－1及其3个亚株的生物学特性差异的分子机制。方法：（1）PCR检测亚株中EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV)的Bam HI W片段;（2）应用原位杂交技术检测SUNE－1及其3个亚株中EBV潜伏膜蛋白1（latent membrane protein l,LMP1)的表达情况。（3）应用比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH)检测SUNE－1及其3个亚株的基因扩增情况。结果：（1）在SUNE－1及其3个亚株中存在EBV BamHI W片段;（2）在3个亚株中,都能够检测到EBV－LMP1的表达,且表达强度一致。（3）CGH检测发现;SUNE－1的DNA拷贝数变呈现以1,2p,,3,4,5p,6,7,9,10q,11,12q,13q,17q和18q增加和22q拷贝数减少为主;5－8F染色体变化以3p,7q,8q,9q和10q拷贝数增加为主;而6－10B降13－9B除少数几人染色体区域发生缺失外,均无DNA拷贝数的增加。结论：鼻咽癌细胞株SUNE－1及其3个亚株,均有EBV的表达和存在不同的染色体变化,提示其生物学特性的差异可能主要由于染色体的变化引起,但EBV的感染对维持鼻咽癌的恶性程度可能起着重要的作用。     

鼻咽癌前期病变中的EB病毒感染

背景与目的：鼻咽癌中的浸润性癌细胞均感染了EB病毒（Epstein-Barr virus．EBV）。前期病变可见于早期鼻咽癌癌旁上皮。本研究旨在通过检测前期病变中的EB病毒,探讨EB病毒感染存鼻咽癌变过程中的作用,及其基因型在鼻咽癌变过程中发生的宿主内演变。方法：采用核酸原位杂交检测15例早期鼻咽癌活检组织中的EB病毒编码RNA（EBV—encoded RNA,EBER）。采用巢式PCR法检测前期病变和癌巢中的EB病毒类型和潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1,LMPI）EB病毒株。具有代表性的LMPI基因羧基末端PCR产物采用四色荧光终止序列技术进行DNA序列分析。结果：所有15例早期鼻咽癌中的绝大多数浸润性癌细胞均呈EBER阳性。在15例的期病变中．14例可检测到EBER阳性的异常上皮细胞和／或浸润性淋巴细胞。单个A型EB病毒可在9例癌巢（11例适用）及9例前期病变（10例通用）的DNA样本中检测到。EB病毒LMP1基因羧基末端在15例癌巢DNA样本中均可检测到,其中14例是30bp缺失型LMP1 EB病毒株,1例是野生型和30bp缺失型LMP1株的混合感染。在11例适合做EB病毒LMP1基因羧基末端扩增的前期病变的DNA样本中,5例呈野生型和30bp缺失型LMP1 EB病毒株的混合感染,4例是单个缺大型LMP1 EB病毒株感染,1例呈单个野生型LMP1 EB病毒株感染,1例呈阴性反应。野生型LMP1基因羧基末端的DNA序列与B95—8细胞的DNA序列完全一致;30bp缺大型LMP1基因羧基末端的DNA序列却其有30bp缺失（密码子：346～355）和4个错义点突变（密码子：334、335、338和366）。结论：鼻咽上皮细胞的EB病毒感染是癌变过程中侵袭前的事件;而在鼻咽癌变过程中,EB病毒基因型会产生宿主内的演变。     

鼻咽癌高危人群血浆EBV-DNA定量分析

目的：探讨鼻咽癌高危人群E病毒DNA（Epstein-Barr virusDNA,EBV—DNA）的存在情况及其在鼻咽癌早期诊断中的应用价值。方法：2009-08-13—2010-07-27在广东省中山市小榄镇开展鼻咽癌筛查,ELISA法检测16712名EBV抗体,确定鼻咽癌高危人群386名,同时收集鼻咽癌低危人群273名。收集同期中山市人民医院初诊鼻咽癌患者62例。荧光定量PCR方法检测高危人群血浆EBV-DNA,并随访1年,比较分析高危人群EBv_DNA定量检测的应用价值。结果：初筛鼻咽癌高危人群EBV—DNA阳性率为12．2％（47／386）,高于鼻咽癌低危人群的3．3％（9／273）,而低于初诊鼻咽癌患者的91．9％（57／62）,3组差异有统计学意义,P〈0．001。随访复查时,血清学持续高危人群EBV—DNA阳性率为9．7％（18／186）,而血清学转变为非高危人群的EBV-DNA阳性率为3．1％（3／97）,差异有统计学意义,P=0．045。筛查人群中血清学诊断鼻咽癌的阳性预测值为5．6％（32／572）,而在鼻咽癌高危人群中增加EBV—DNA检测,其阳性预测值提高到44．6％（29／65）。结论：鼻咽癌高危人群血浆EBV-DNA定量检测能对血清学EBV抗体检测进行有效的补充,可大大提高筛查准确性,对鼻咽癌高危人群的监测具有重要作用。     

鼻咽癌患者血浆EBV DNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的检测及临床应用

目的：探讨血浆EB病毒DNA、血清细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）和EB病毒壳抗原IgA（VCA-IgA）三种肿瘤标记物对鼻咽癌诊断、疗效监测和预后判断的临床应用价值。方法：分别采用荧光定量PCR法、电化学发光法和免疫酶法检测62例鼻咽癌患者治疗前、后及62例健康对照者血浆EBV DNA、血清CY-FRA21-1和VCA-IgA含量,并进行对比分析。结果：治疗前血浆EBV DNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的阳性率明显高于健康对照组（P〈0.01）;治疗后血浆EBV DNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA含量高者,在随访中发现肿瘤残存、复发或远处转移。结论：血浆EBV DNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的检测对鼻咽癌早期诊断、高危人群筛查、以疗效监测和预后判断有重要临床应用价值,三种肿瘤标记物联合检测有互补作用。     

EB病毒与鼻咽癌相关性的研究进展

Epstein-Barr病毒（EBV）的潜伏感染与鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）密切相关,在感染人体后长期潜伏,可表达多种基因,其潜伏膜蛋白（LMP）编码基因、EB病毒核抗原（EBNA）基因及EBV编码的小RNA（EBER）可以通过不同的机制致鼻咽癌。本文就EBV与NPC的关系,与NPC相关的EBV的生物学特性和进展作一综述。     

鼻咽癌患者鼻咽拭子中EB病毒LMP1基因C末端的变异及序列分析

目的研究LMP1基因C端区在宁波地区鼻咽癌患者中的变异状况,并探讨其在鼻咽癌中所起的作用。方法通过鼻咽拭子的方法采集鼻咽癌患者的病变黏膜上皮及分泌物,采用聚合酶链反应（PCR）扩增鼻咽癌患者鼻咽拭子中的LMP1基因C末端,并对其进行序列分析。结果30例鼻咽癌患者的鼻咽拭子标本中有28例显示出阳性条带,且都存在序列变异,而正常对照标本无一扩增得到,特异性为100.0%。28例阳性标本中有7例标本存在30 bp的缺失突变,缺失率为25.0%。结论宁波地区的鼻咽癌鼻咽拭子中LMP1基因C端高变区30 bp的缺失型约占25.0%,不是主要流行型。     

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端XhoⅠ酶切位点的丢失

背景与目的:众所周知, EB病毒 LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用.本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织 EB病毒 LMP1基因 N-末端区 XhoⅠ酶切位点的丢失,探讨 LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用.方法 :收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本 63例.收集 EB病毒健康携带者外周血单个核细胞 (PBMCs) 10例作为对照.采用 QIAamp DNA Mini Kit和 QIAamp DNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的 DNA,应用巢式 PCR扩增 EB病毒 LMP1基因的 N-末端区,并用 XhoⅠ对扩增产物进行酶切.采用四色荧光 末端终止法对扩增产物进行序列分析.结果: 10例健康携带者外周血单个核细胞的 EB病毒 LMP1基因 N-末端区均未见 XhoⅠ酶切位点的丢失.63例鼻咽癌组织中有 50例(79.37%)出现 XhoⅠ酶切位点的丢失(XhoⅠ-loss),还有 4例(6.34%)为 XhoⅠ酶切位点部分丢失,只有 9例(14.29%)未见 XhoⅠ酶切位点的丢失(wt-XhoⅠ ).除了 XhoⅠ酶切位点的丢失 (nt: 169423～169428; GAGCTC→ GATCTC)外,还发现四个错义点突变.结论:本研究所检测的广东地区 EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的 EB病毒 LMP1基因为 wt-XhoⅠ,而在鼻咽癌组织中主要为 XhoⅠ-loss.因此,我们认为 EB病毒 LMP1基因 N-末端区 XhoⅠ酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的.     

EB病毒感染与鼻咽癌发病机制的关系

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种在中国南方、台湾、新加坡及特定地域的其它国家或地区很常见的肿瘤,其发病因素尚不明确。目前,还未发现与NPC发生过程的遗传因素有关的主要基因;而一些环境因素可能与诱发NPC有关。如食用腌鱼和长期暴露于硫酸蒸汽,研究指出EB病毒（Epstein—Barr virus,EBV）与NPC发病机理密切相关。为了探索NPC与EBV之间的关系,我们建立了10个NPC细胞株。经过广泛研究,我们认为EBV通过IgA受体（分泌组分蛋白）介导的细胞内吞作用,可能仅感染鼻咽肿瘤细胞,而不感染化生上皮细胞。我们发现EBV对于促进NPC进展起着重要作用,但并不参与启动及促进NPC的发生。     

p73基因及其蛋白在鼻咽癌中表达的临床意义

目的分析p73基因及其蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性。方法采用实时荧光定量PCR（RQ-RT-PCR）法检测52例鼻咽癌组织和25例正常鼻咽组织p73基因表达水平,采用免疫组织化学染色法检测p73蛋白的表达水平,并分析它们与各项临床病理指标的相关性。结果52例鼻咽癌组织中p73基因表达阳性38例（73．1％）,蛋白阳性表达37例（71．2％）;鼻咽正常组织中p73基因表达阳性6例（24．0％）,蛋白阳性表达9例（36．0％）。p73基因及其蛋白在鼻咽癌组织中的表达均高于正常鼻咽组织,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,且p73基因及其蛋白的表达与癌组织的浸润深度、病理分化程度、临床分期密切相关（P〈0．05）,与患者的年龄、性别无关（P〉0．05）。结论检测p73基因及其蛋白的表达将对鼻咽癌的诊断、预后判断具有重要的临床意义。     

鼻咽癌调强放疗对臂丛神经受量的影响

目的：回顾性分析鼻咽癌调强放疗对双侧臂丛神经受量的影响。方法：选择已完成调强放射治疗的10例鼻咽癌患者,所有患者明确诊断伴有颈部淋巴结转移,且均接受30次调强放疗。再由一名主治医师在原始的CT图像上勾画出双侧的臂丛神经,最后通过DVH图对双侧的臂丛神经受量进行分析,包括臂丛神经的最大剂量点（Dmax）及平均剂量（Dmean）。结果：双侧臂丛神经的最大剂量点（Dmax）均值为6961．9cGy;平均剂量（Dmean）的均值为5738．6cGy。结论：大部分没有对臂丛神经进行剂量限制且伴有颈部淋巴结转移并接受调强放疗的鼻咽癌患者,其臂丛神经的照射剂量均高于RTOG推荐的限制剂量。     

EB病毒miRNAs在鼻咽癌细胞株C666-1和CNE-2Z中的差异性表达分析

目的：探讨ebv-miRNA在低分化NPC细胞株C666-1（EBV＋）和CNE-2Z（EBV表达水平随传代次数增加而逐渐降低）中的差异性表达进而分析其功能.方法：常规培养NPC细胞株C666-1和CNE-2Z,分别提取总RNA并进行质检;RT-PCR检测LMP-1和LMP-2A mRNA的表达以判断EBV的感染情况;miRNA芯片技术检测EBV miRNAs的表达并对其表达谱进行差异性分析;荧光定量RT-PCR进行验证;复习文献了解ebv-miRNA调控的靶基因以了解其功能.结果：从C666-1和CNE-2Z两株细胞抽提的总RNA纯度高,A260/A280〉2.0,A260/A230〉2.1,RNA完整性好.C666-1具有比CNE-2Z更高的LMP-1和LMP-2A mRNA表达.ebv-miRNA表达谱的差异分析表明39个ebv-miRNAs中19个在两株细胞显著差异性表达;荧光定量RT-PCR结果证实ebv-miR-BHRF1-1和ebv-miR-BART14＊在C666-1中表达升高而ebv-miR-BART8＊表达降低,与芯片结果趋势一致;复习文献,EBV miRNAs功能远不清楚,少数已知的靶基因涉及信号转导、转录调控、细胞凋亡、增殖、免疫反应和病毒DNA复制等方面.结论：ebv-miRNA在低分化NPC中具有差异性表达并广泛参与基因调控.不同NPC细胞中EBV miRNA表达差异预示着基于ebv-miRNA的NPC个性化治疗的可能性.