新型聚β-羟基丁酯作为血管组织工程支架材料的实验研究

目的：探讨经改性处理后的可降解生物材料聚β-羟基丁酯(PHB)作为血管组织工程支架材料与血管平滑肌细胞的细胞相容性。方法：采用体外培养的免血管平滑肌细胞接种在经胶原包埋处理后的管型PHB支架材料上，用相差显微镜和扫描电镜观察细胞的粘附和生长情况，并行HE染色观察。结果：免血管平滑肌细胞在改性后的管型PHB支架材料上粘附生长良好，扫描电镜下可见细胞生长融合成片状，HE染色示细胞在PHB材料上生长良好。结论：改性后的聚β-羟基丁酯材料与兔血管平滑肌细胞有较好的生物相容性。     

兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯(PHB)的细胞相容性实验研究

目的：探索血管平滑肌细胞和新型可降解材料聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性，为组织工程血管的构建寻找理想的支架材料。方法：将组织块法体上培养与兔血管平滑肌细胞种植在PHB膜片和PHB三维微孔支架上，在相差显微镜下观察细胞的粘附和生长情况。用MTT法测定细胞粘附率和细胞增殖指数，复合培养7天后进行扫描电镜观察并用流式细胞仪（FCM）的测定细胞周期，DNA指数。结果：兔血管平滑肌细胞在PHB膜片上粘附率为77％，细胞增殖符合细胞的生长曲线，在PHB三维微孔支架上生长情况良好，并被证实为二倍体细胞。结论：兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性较好，但细胞与材料间的粘附有待进一步改善。     

新型脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备

目的 探讨脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备方法以及将其应用于关节软骨组织工程的可行性. 方法 取天然人软骨粉碎后,采用梯度离心法取100 nm～5μm软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量体积比为3%的悬液,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架.254nm紫外线和碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联.冷冻冻干后,对支架材料进行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率,并采用MTT法分析支架浸提液毒性.分离培养犬BMSCs,用TGF-β1成软骨诱导后种植至支架,倒置显微镜、电镜观察细胞在支架上的生长、分化情况. 结果 组织学观察显示,三维多孔支架中无软骨细胞碎片残留,甲苯胺蓝染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性.扫描电镜显示支架内孔洞相互连通,孔径为(155±34)μm,孔隙率为91.3%±2.0%,吸水率为2 451%±155%.MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P＞0.05),支架无细胞毒性.倒置显微镜观察,细胞在支架上黏附良好;扫描电镜下细胞在支架上均匀分布,细胞呈圆形或椭圆形,并有基质分泌. 结论 制备的脱细胞软骨基质三维多孔支架去细胞彻底,保留了软骨ECM主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是软骨组织工程良好的支架载体.     

脱细胞羊膜的制备及其生物相容性研究

目的制备脱细胞人羊膜(HAAM),检测其细胞相容性和组织相容性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性. 方法新鲜人羊膜经漂洗后戊二醛交联,0.5%SDS震摇24小时,胰蛋白酶消化4小时,充分漂洗,冷冻干燥,分装,环氧乙烷消毒备用.倒置相差显微镜和扫描电镜观察表面结构,测量孔径,并作HE、Mallory染色.体外培养人成纤维细胞并复合于HAAM,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附、生长,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定HAAM浸提液对培养的人成纤维细胞的细胞毒性.将HAAM植入SD大鼠背部皮下,观察其组织相容性. 结果 HAAM的一面为网状结构,孔径为10～80 nm,另一面为致密纤维结构.HE、Mallory染色表明材料无细胞残留,均为胶原组成.成纤维细胞能在HAAM上黏附、增殖.MTT示材料细胞毒性为0或1级,动物埋置实验无异常反应. 结论应用去垢剂-酶消化法处理新鲜人羊膜,能有效去除组织中的细胞和可溶性成分,可进一步降低其免疫原性,保留基质及网状结构,有良好的细胞相容性和组织相容性,可作为组织缺损的修复材料及组织工程的膜支架材料.     

来源于长管状骨的组织工程纤维环支架的理化特性及细胞生物学相容性研究

[目的]以来源于长管状骨的骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)为材料制备纤维环支架,并检测其理化特性及细胞生物相容性.[方法]以猪股骨近端松质骨为材料,制备外径为1 cm、内径为0.5 cm的中空环,经脱钙脱细胞处理后制成纤维环支架.支架行Hoechst 33258、HE、Ⅰ型胶原免疫荧光、天狼星红染色,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察并计算孔径,同时进行生物力学测定.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)检测支架不同浓度浸提液的细胞毒性,取P1代山羊纤维环细胞,用注射器将细胞接种至支架上,体外培养48 h,通过活/死细胞染色(LIVE/DEAD cells staining)、扫描电镜(SEM)、HE染色评价支架与细胞的生物相容性.[结果]大体观察支架表面光滑,呈乳白色,扫描电镜支架孔隙分布较均匀且相连通,支架孔径为(401.4±13.1) μm,Hoechst 33258、HE染色均未见细胞残留,Ⅰ型胶原免疫荧光阳性,天狼星红染色支架红染,支架压缩弹性模量为(47.75±6.32) kPa.四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组间细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05),活/死细胞染色示细胞在支架上呈绿色荧光,扫描电镜和HE染色示细胞粘附在支架孔隙表面及周围,有基质分泌.[结论]以来源于长管状骨的骨基质明胶为材料制备的中空环形支架脱细胞彻底,具有合适的孔径结构,在机械性能、组成方面与正常纤维环相接近,具有良好的生物相容性,符合组织工程纤维环支架载体的条件.     

软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

胶原凝胶复合骨胶原基质(BCM)负载关节软骨细胞的实验研究

目的 探讨胶原凝胶包埋软骨细胞接种BCM支架的三维培养对软骨细胞生长及功能的影响.方法 将胶原凝胶包埋的关节软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色观察软骨组织形成情况.结果 软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论 胶原凝胶复合BCM支架具有良好的细胞相容性,可作为负载生长因子的载体.     

基于心脏全器官脱细胞基质的组织工程支架材料制备与生物学评价北大核心CSCD

目的探讨一种心脏全器官脱细胞方法,并对制备的心脏脱细胞基质支架进行检测与评价。方法通过联合使用胰蛋白酶、Triton X-100等洗涤剂,对成年SD大鼠离体心脏进行主动脉逆行灌流脱细胞处理。对制备的心脏脱细胞基质支架进行大体观察、甲苯胺蓝灌流染色、HE染色、扫描电镜观察、阿利新蓝染色、细胞外基质组分免疫组织化学染色等观察。结果成功制备心脏全器官脱细胞基质支架材料,其保留了原心脏的大体形态;HE染色、甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察显示其保留了较好的脉管结构与超微空间构象;阿利新蓝染色及免疫组织化学染色结果显示,其主要的细胞外基质成分,包括Ⅰ型胶原、糖氨聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白保留良好。结论制备的大鼠心脏脱细胞基质支架保留了心脏原有的结构与细胞外基质成分,有望作为全器官心脏体外再造的良好组织工程支架材料。     

生物可降解材料聚β-羟基丁酯对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：检测生物可降解材料聚β-羟基丁酯(PHB)对兔骨髓基质细胞(BMSC)形态、生长、附着及增殖的影响。方法：将家兔BMSC进行体外培养，以诱导剂(β-甘油磷酸钠，地塞米松，L-抗坏血酸)使其向成骨细胞分化，行碱性磷酸酶染色并计算阳性率，将PHB与成骨细胞样细胞进行体外复合培养，用倒置显微镜及扫描电镜观察PHB对BMSC的形态、生长、附着及增殖的影响。结果：在诱导剂的作用下BMSC向成骨细胞分化，碱性磷酸酶染色呈阳性，其阳性率随培养时间延长而增加。PHB与成骨细胞样细胞进行体外复合培养后显示PHB对BMSC的形态、生长、附着及增殖均无不良影响。结论：PHB具有良好的生物相容性，可望与骨髓复合移植修复骨缺损。     

医用多孔钽材料对大鼠软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

[目的]观察国产多孔钽材料对大鼠软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,为其作为软骨组织工程支架材料临床应用提供实验依据。[方法]选用3周龄SD大鼠双侧股骨头、膝关节分离软骨组织,经Ⅱ型胶原酶消化,饱和湿度培养,传代。倒置显微镜下逐日观察细胞生长状态。待第2代细胞生长至80%左右时,通过甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色以及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行软骨细胞鉴定。以F12-DMEM为浸提介质分别制备100%、50%、25%多孔钽浸提液,软骨细胞加不同浓度多孔钽浸提液作为实验组,未加浸提液的软骨细胞作为对照组;MTT法检测多孔钽浸提液对软骨细胞增殖的影响及细胞毒性检测。将第2代软骨细胞接种到多孔钽支架上进行体外三维培养,而对照组是将软骨细胞接种到无支架的培养板上,倒置相差显微镜观察两组软骨细胞生长状态;胰酶消化复合于材料上的软骨细胞,流式细胞仪检测软骨细胞的细胞周期变化及细胞凋亡。[结果]软骨细胞接种初期大小不等,呈圆形悬浮于培养液中,24 h后贴壁细胞伸展呈三角形、多角形等。第7⁹ d待细胞生长呈现融合时即可传代。甲苯胺蓝染色显示软骨细胞胞浆内可见蓝紫色颗粒,番红O-固绿染色显示胞浆呈绿色、细胞核呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色显示阳性信号位于胞浆及部分胞膜,以上方法证实了分离培养的细胞为软骨细胞;MTT法检测显示随着培养时间的延长,各浓度浸提液组细胞生长与对照组无明显差异,软骨细胞形态正常,贴壁增殖良好,相同时间点不同浓度的浸提液与对照组间细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05),提示软骨细胞在多孔钽浸提液中生长、增殖状态良好且多孔钽材料无毒性。多孔钽支架材料外观灰色光亮,表面及断面可见分布均匀的蜂窝状孔隙,孔径针尖大,支架材料不透光,将分离培养的第2代软骨细胞接种到多孔钽支架上后,复合培养24 h后,倒置相差显微镜可见材料边缘有少量软骨细胞黏附,细胞呈多角形;随着培养时间增加,材料边缘及培养板底部细胞黏附的数量逐渐增多,边缘软骨细胞生长良好;流式细胞仪检测显示实验组与对照组细胞均为正常二倍体细胞,两组细胞周期分布相似,实验组及对照组的细胞凋亡率及坏死细胞率差异均无统计学意义(P>0.05)。[结论]国产多孔钽材料无毒性,对软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡无明显影响,适合作为软骨组织工程支架材料。