腺病毒介导VEGF基因在人骨髓基质干细胞中的表达

[目的] 体外培养人骨髓基质干细胞(hBMSc),将VEGF165基因腺病毒载体共转染hBMSc,观察其表达.[方法] 共转染实验分为3组:VEGF165和eGFP转染组、空腺病毒载体转染组和未转染组.取重组腺病毒Ad-VEGF165(MOI=20 pfu/cell)感染hBMSe.荧光显微镜下观察eGFP的表达,判断感染效率及细胞生长情况,RT-PCR检测,ELISA和Westernblot检测分别用于观察基因转染的表达.[结果] MOI=20 pfu的转染率已达80%以上,取此值为转染滴度.提取出的总RNA质量较好.以双链cDNA为模板扩增VEGF165基因,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,均可见到549 bp(GAPDH)2条带.转染组可见VEGF165表达,空载体组和空白对照组未检测到VEGF165表达.ELISA结果显示基因转染组与转染空载体组和未转染组结果差异呈显著性(P<0.05).Western blot显示:转染组在50 KD处出现特征性条带,而空载体组和空白对照组未见条带.[结论] 外源性VEGF基因在人骨髓基质干细胞(hBMSc)内获得稳定表达,在本实验条件下培养的hBMSc具有典型成骨细胞的形态学特征和较强的生物学活性,向成骨细胞方向分化效率较高,细胞数量可以满足骨组织工程研究的要求.     

人BMP-7及VEGF基因共表达腺病毒的构建及在兔骨髓基质干细胞中的共表达

目的：构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒AdB7V，体外感染rBMSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达。结果：rBMSC经AdB7V感染后72h可观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达，RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7及VEGF165基因均可在rBMSC中表达。结论：成功构建人BMP-7及VEGF165基因共表达重组腺病毒，证实了其在rBMSC的表达，为骨再生的局部联合基因治疗打下基础。     

人BMP-7及VEGF基因共表达腺病毒的构建及在兔骨髓基质干细胞中的共表达

目的:构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达.方法:利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒AdB7V,体外感染rBMSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达.结果:rBMSC经AdB7V感染后72h可观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7及VEGF165基因均可在rBMSC中表达.结论:成功构建人BMP-7及VEGF165基因共表达重组腺病毒,证实了其在rBMSC的表达,为骨再生的局部联合基因治疗打下基础.     

狗骨髓基质细胞的体外诱导成骨潜能研究

目的：观察狗骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法：采用成年狗双侧髂骨取材进行骨髓基质细胞培养，应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法观察细胞增殖；以对硝基苯磷酸盐法及骨钙素含量放免测定法测定碱性磷酸酶活性及骨钙素含量；用Von Kossa染色法观察矿化结节；用间接免疫荧光染色法测定Ⅰ型胶原。观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果：骨髓基质细胞呈成纤维样表现，增殖力强。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素含量明显增高，Ⅰ型胶原表达增多，10～12d达到高峰，并出现矿化结节。结论：狗骨髓基质细胞在本实验条件下，成骨能力肯定，增殖能力强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

血管内皮生长因子165基因转染的骨髓基质细胞异位成骨的初步研究

目的：将血管内皮生长因子165（VEGF165）基因转染的大鼠骨髓基质细胞（MSCs）和β-磷酸三钙复合后,植入原大鼠肌肉中,探索转染外源基因的MSCs异位成骨能力。方法：SD大鼠12只,在全麻及无菌条件下取其左侧股骨的骨髓基质细胞,并用矿化液诱导培养。在脂质体介导下将构建成功的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165转染到诱导培养的MSCs,G-418筛选阳性细胞克隆,将阳性克隆细胞和未转染的MSCs共同接种于β-磷酸三钙上,体外培养7天后,植入原大鼠肌肉内。分别于4周、8周和12周处死动物,观察异位成骨情况。结果：骨髓基质细胞-β-磷酸三钙复合体植入肌肉后,材料周围血管生长较多,随着植入时间的延长,小的骨岛逐渐融合为大的骨块,并有骨髓腔样结构,表现出较好的异位成骨能力。结论：应用VEGF165基因转染MSCs作为种子细胞植入体内后,有利于发挥VEGF165的血管化作用,同时促进组织工程骨的成骨速度,将会成为组织工程骨血管化探索的方向。     

种植转染VEGF165基因骨髓基质细胞的脱蛋白异体骨在裸鼠体内的成骨

目的:探讨脱蛋白骨支架种植转染血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓基质细胞体内的成骨作用.方法:从狗的髂骨穿刺骨髓分离骨髓基质细胞,应用脂质体转染VEGF165基因,以RT-PCR检测转染的基因表达.随机选取4周龄BALB/C裸鼠30只,随机分为3组,各组10只.实验组A为脱蛋白骨 转染pcDNA3-hVEGF165基因的骨髓基质细胞;实验组B为脱蛋白骨 骨髓基质细胞;对照组C为单纯植入脱蛋白骨 DMEM.在脊柱两侧分开肌间隙,每只裸鼠植入2块脱蛋白骨材料至肌腹内.术后4、8周处死取材,经大体观察、组织形态学与免疫组化方法检查细胞材料复合物植入后的成骨作用及VEGF表达.结果:组织学检查A、B组均有成骨,并随时间延长而新骨增多,但其中转基因的A组其成骨作用明显,并在植入4周后免疫组化可见VEGF表达呈阳性;对照组C无成骨现象.结论:转染VEGF165基因骨髓基质细胞复合脱蛋白骨在体内具有较好的成骨作用.     

NucleofectorTM电转仪转染外源基因至骨髓基质细胞优化方案

目的用Nucleofector^TM电转仪介导真核表达载体pEGFP-C1及pEGFP-C1-PDX-1转染大鼠骨髓来源细胞，并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法将已构建好的重组载体以Nacleofector^TM电转仪转染不同方法获得的骨髓来源细胞，改变DNA的量、转染后血清浓度，在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率；转染后48h进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测目的基因的表达情况。结果相同条件下转染骨髓来源的神经干细胞（NSC）较转染骨髓基质细胞（MSC）可获得更高的转染效率；质粒2～10雌获得最佳的转染效率；提高转染后培养基的血清浓度可提高转染后细胞存活率及转染效率；RT-PCR检测转染后骨髓来源nestin＋细胞有PDX-1表达。结论通过优化转染条件提高了pEGFP-C1-PDX-1转染大鼠骨髓来源nestin＋细胞的效率，为成为组织工程的种子细胞提供了实验依据。     

地塞米松在人骨髓基质细胞诱导成骨细胞中的作用

目的 通过对人骨髓基质细胞体外培养及检测，研究地塞米松在骨髓基质细胞体外增生并向成骨细胞定向分化过程中的应用。方 法骨折内固定术扩髓前收集髓腔内骨髓进行原代和传代培养，传代后改用条件培养基（含地塞米松）和基础培养基（不含地塞米松）分别进行培养，应用组织化学及von Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶和细胞外基质矿化程度；半定量RT-PCR方法检测Cbfal mRNA和Osterix mRNA在细胞培养过程中不同时间点的表达。并观测地塞米松对上述成骨细胞相关基因表达的影响。结果 条件培养基组细胞Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达峰值高于基础培养基组细胞，并且峰值出现的时间提前。结论 地塞米松通过促进Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

VEGF转染对骨髓基质细胞成骨功能的影响

[目的]将血管内皮生长因子121(vascular endothelial growth factor 121,VEGF121)基因转染兔骨髓基质细胞(rabbit bone marrow stroma cells,rMSCs)后,研究转染后细胞的成骨功能变化,为进一步利用经基因转染的rMSCs构建组织工程骨血管化打下基础.[方法]体外培养、扩增rMSCs,将其分为转染组和未转染组,脂质体介导下PCDI- VEGF121真核表达质粒转染rMSCs后,G- 418筛选阳性细胞克隆.通过RT - PCR法检测VEGF mRNA水平,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原检测来评价两组细胞的成骨能力.将阳性克隆细胞和未转染的细胞植入裸鼠股部肌袋内.分别于植入后4、8周处死动物,观察异位成骨情况.[结果]转染组和未转染组的ALP表达随着时间逐渐增强,转染组细胞内ALP水平显著增高,Ⅰ型胶原在转染组细胞内高表达,转染组的rMSCs植入肌袋后,随着植入时间的延长,出现骨髓腔样结构及大量骨小梁,表现出较好的异位成骨能力.[结论]应用VEGF121基因转染rMSCs后,有利于发挥VEGF121的血管化作用,促进rMSCs的成骨能力,将会成为组织工程骨血管化探索的方向.     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因在骨髓基质细胞中的共表达

目的 观察骨形成蛋白(BMP)-2、转化生长因子(TGF)-β1双基因真核表达载体在骨髓基质细胞中的共表达.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1为模板,分别用引入新的酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增出1188 bp长度的BMP-2和1173 bp长度的TGF-β1两个目的 基因片段;依次将其定向克隆入真核双基因表达载体pIRES;酶切、分析及序列测定重组子:然后,用脂质体包裹转染骨髓基质细胞;荧光定量逆转录(RT)-PCR方法 检测BMP-2及TGF-β1基因的共表达情况.结果 双酶切可见1188 bp的BMP-2条带及核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-131构建正确,并在骨髓基质细胞中能同时高效表达BMP-2和TGF-β1 mRNA.结论 BMP-2和TGF-β1双基因真核载体能够在骨髓基质细胞中实现BMP-2和TGF-β1基因共表达.     

自制脱蛋白骨与骨髓基质细胞的生物相容性研究

目的 探讨表面脱钙的脱蛋白异体骨与骨髓基质细胞的生物柑容性，为骨组织工程提供合适的支架材料。方法 用经物理与化学方法处理而制得的脱蛋白骨与骨髓基质细胞（MSCs)复合培养，进行形态学观察、细胞增殖、ALP的活性、骨钙素的分泌与蛋白质含量检测；扫描电镜观察细胞在脱蛋白骨材料上的情况。结果 骨髓基质细胞能在脱蛋白骨上贴附、增殖，其生长及功能不受影响。结论 本方法所制的脱蛋白骨与MSCs具有良好的生物相容性，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程。     

A new source for cardiovascular tissue engineering: human bone marrow stromal cells

Objective: Vascular-derived cells represent an established cell source for tissue engineering of cardiovascular constructs. Previously, cell isolation was performed by harvesting of vascular structures prior to scaffold seeding. Marrow stromal cells (MSC) demonstrate the ability to differentiate into multiple mesenchymal cell lineages and would offer an alternative cell source for tissue engineering involving a less invasive harvesting technique. We studied the feasibility of using MSC as an alternative cell source for cardiovascular tissue engineering. Methods: Human MSC were isolated from bone marrow and expanded in culture. Subsequently MSC were seeded on bioabsorbable polymers and grown in vitro. Cultivated cells and seeded polymers were studied for cell characterization and tissue formation including extracellular matrix production. Applied methods comprised flow cytometry, histology, immunohistochemistry, transmission (TEM) and scanning electron microscopy (SEM), and biochemical assays. Results: Isolated MSC demonstrated fibroblast-like morphology. Phenotype analysis revealed positive signals for alpha-smooth muscle actin and vimentin. Histology and SEM of seeded polymers showed layered tissue formation. TEM demonstrated formation of extracellular matrix with deposition of collagen fibrils. Matrix protein analysis showed production of collagen I and III. In comparison to vascular-derived cell constructs quantitative analysis demonstrated comparable amounts of extracellular matrix proteins in the tissue engineered constructs. Conclusions: Isolated MSC demonstrated myofibroblast-like characteristics. Tissue formation on bioabsorbable scaffolds was feasible with extracellular matrix production comparable to vascular-cell derived tissue engineered constructs. It appears that MSC represent a promising cell source for cardiovascular tissue engineering.     

骨髓基质干细胞与珊瑚复合物体内回植时间的研究

目的　探索骨髓基质干细胞和珊瑚复合物的体内回植时间。方法　骨髓基质干细胞经成骨诱导分化后与珊瑚复合 ,体外培养 1、3、5、7d时行相差显镜镜、扫描电镜观察 ,并行裸鼠皮下回植。结果　 3d时 ,骨髓基质干细胞与珊瑚达到较好的复合状态 ,皮下回植有新骨形成。结论骨髓基质干细胞与珊瑚复合后体外培养 3d时就可以体内回植。     

含锌煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞构建组织工程骨

目的　探讨含锌煅烧牛松质骨和单纯煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞 (MSCs)构建的组织工程骨在体内的成骨能力。方法诱导培养骨髓基质细胞 ,将其分别接种至含锌煅烧牛松质骨及单纯煅烧牛松质骨 ,植入肌肉内 ,分别于术后 4、8周处死实验动物 5只 ,行组织学观察和新生骨面积测定。结果　术后不同时间组织学观察含锌组新生骨明显多于单纯组 ,新生骨面积测定值含锌组分别为 (17619.14 5± 44 5 9.816)、(2 5 2 3 8.5 3 9± 1995 .164 ) μm2 ,单纯组分别为(80 5 6.5 3 7± 5 67.60 3 )、(10 787.95 7± 92 5 .5 0 9) μm2 。含锌组明显大于单纯组 (P <0 .0 5 )。结论　含锌煅烧骨作为骨组织工程的支架材料优于单纯煅烧骨 ,是一种理想的生物活性支架材料。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

体外诱导小鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化相关基因表达的研究

目的体外培养小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为成骨细胞,定量分析其骨生成关键标志基因的表达水平。方法体外培养小鼠BMSCs 7、14、21 d,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPIN)和骨唾液酸蛋白(BSP)基因的表达水平。结果小鼠BMSCs体外稳定增殖和分化,Ⅰ型胶原培养14 d和21 d mRNA水平分别是培养7 d时的0．75±0．04倍和(0．34±0．03)倍;ALP、OPN和BSP基因表达水平随着培养时间延长而上升,其中培养21 d时的ALP、OPN和BSP mRNA水平分别是培养7 d时的(19．70±2．36)倍、(150．12±9．31)倍和(7．73±0．58)倍。结论荧光定量RT-PCR可以灵敏地检测成骨细胞关键标志基因表达水平,随着培养时间延长,Ⅰ型胶原的表达水平逐渐下降,而ALP、OPN和BSP的表达水平显著上升。     

人骨髓基质干细胞体外诱导培养的新方法研究

目的为骨组织工程的临床应用提供一种新的人骨髓基质干细胞(BMSCs)培养方法,以满足细胞培养过程中对各类细胞因子的需求,同时尽量减少细胞培养过程中动物源性抗原物质的引入。方法采用10%富血小板血浆(PRP)替代动物血清配比高糖DMEM培养基,体外诱导培养(50μg/mL抗坏血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠)人BMSCs,快速扩增后,倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及细胞增殖情况。ALP染色与钙结节染色等方法对细胞进行生物学特性检测。结果人BMSCs24h开始贴壁,7d左右细胞融合。诱导培养后细胞能较快地扩增;ALP染色与钙结节染色结果显示细胞具有良好的成骨细胞生物学特性。结论以自体PRP替代动物血清体外诱导培养人BMSCs是一种良好的培养方法,所培养的细胞数量及其生物学特性能快速达到临床应用的需求。     

rhBMP-2对兔骨髓基质细胞VEGF表达及成骨潜能的影响

目的：观察经不同剂量重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogeneti protein-2，rhBMP-2)刺激后的兔骨髓基质细胞(marrow stromal cell，MSC)，其血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达及成骨潜能变化的情况。方法：取兔双侧股骨骨髓基质细胞体外培养，分别以不同剂量rhBMP-一2刺激细胞，并设立空白对照组。培养5d后，进行细胞形态(胍染色)、增殖情况(细胞记数法与MTT法)、碱性磷酸酶(组化染色与活性测定)、钙化结节(图像分析)、VEGF阳性细胞率(免疫组化染色)等项目的检测。结果：不同剂量组间在碱性磷酸酶活性、矿化面积百分率、VEGF阳性细胞率三项观测指标上差异显著，rhBMP-2剂量为100ng／ml左右时效果最佳；在细胞记数与MTT检测上各组差别不显著。结论：应用rhBMP-2在促进基质细胞成骨潜能的同时，还可促进VEGF的表达，其应用剂量与效果之间存在明显相关关系，应用剂量为100ng／ml左右时，其促进VEGF表达及成骨潜能作用同时达到最佳效果，超过此应用剂量，两者则有下降趋势。应用rhBMP-2对促进骨髓基质细胞增殖无明显影响。