结核分枝杆菌CFP-10单克隆抗体的研制与初步鉴定

目的:制备抗结核分枝杆菌CFP-10蛋白的单克隆抗体(mAb).方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)-pET-30a(+)-lhp原核表达的融合蛋白His-CFP-10作为抗原免疫BALB/c小鼠,以纯化的融合蛋白GST-CFP-10作为检测抗原,制备抗结核分枝杆菌CFP-10 mAb;采用间接ELISA、Dot-ELISA和Western blot鉴定mAb的特异性.结果:获得2株稳定分泌抗结核分枝杆菌CFP-10 mAb的杂交瘤细胞株6E8、2E7,其Ig亚类分别为IgG1、IgG2b.mAb 6E8、2E7腹水的ELISA效价分别为1:1 000 000,1:1 024 000.在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-CFP-10及GST-CFP-10的重组大肠杆菌反应,与其他5种菌株均不发生反应.在Western blot试验中,2株mAb只与CFP-10蛋白发生反应,出现特异性条带.结果表明,mAb 6E8、2E7是针对结核分枝杆菌CFP-10的特异性mAb.结论:成功地制备抗结核分枝杆菌CFP-10的mAb,它们在结核分枝杆菌诊断和致病机理研究等方面有重要应用价值.     

河南华溪蟹金属硫蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备小鼠抗河南华溪蟹金属硫蛋白(MT)单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法分别利用小泛素样修饰蛋白(SUMO)融合表达系统和碱性磷酸酶(phoA)分泌表达载体制备河南华溪蟹重组蛋白SUMO-MT和His-MT,以SUMO-MT为免疫抗原、His-MT为检测抗原,利用杂交瘤技术建立抗河南华溪蟹MT mAb杂交瘤细胞株。采用间接ELISA测定mAb腹水效价,Western blot法、Dot-ELISA分析mAb的特异性。结果成功建立了2株稳定分泌抗MT蛋白的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为mAb-MT2和mAb-MT3,均属于IgG1亚类。腹水效价分别为1∶500 000、1∶1000 000,Western blot和Dot-ELISA结果证实2株mAb均能特异性识别重组MT和内源性MT。结论成功制备了具有较高特异性的河南华溪蟹MT mAb。     

抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以重组P6蛋白腹腔免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合技术制备杂交瘤细胞株;间接ELISA筛选阳性细胞克隆并检测染色体数目;测定细胞培养上清的mAb效价及特异性,鉴定mAb的免疫球蛋白类、亚类及抗原结合表位。结果获得2株抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的杂交瘤细胞株α2G3和γ2C4,染色体众数分别为103与95;间接ELISA结果证明细胞培养上清最高效价分别为1∶256和1∶512,未出现与其他种类细菌的交叉反应;α2G3为IgG2b、γ2C4为IgM,均为κ型;两者可能识别P6蛋白不同表位。结论成功制备了抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的mAb。     

重组人颗粒溶素的纯化及其单克隆抗体的制备

目的:纯化原核系统表达的颗粒溶素(GNLY),并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:用Ni亲和层析纯化重组人GNLY,用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。mAb纯化后,用间接ELISA法测mAb的效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸盐洗脱法测定mAb的相对亲和力指数,并进行Ig亚类、特异性及杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性检测。结果:经Ni亲和层析纯化的可溶性GN-LY融合蛋白,其纯度和含量分别为95%和0.8g/L。共筛选出能稳定分泌抗人GNLYmAb的杂交瘤细胞4株,分别为6C8、9C6、5G7和5E5。4株杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价分别为1∶100～1∶3200和(0.1～8)×10-4,5E5mAb的Ig亚类为IgM,其余3株mAb均为IgG1。结论:成功地纯化人GNLY融合蛋白。以其为免疫原制备的鼠抗人GN-LYmAb,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

抗鸡白细胞介素4单克隆抗体的制备及其鉴定北大核心CSCD

目的制备抗鸡白细胞介素4(ChIL-4)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以重组鸡IL-4(GST-ChIL-4)作为免疫原免疫8周龄BALB/c小鼠,以重组蛋白His-ChIL-4作为检测抗原建立筛选阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA;以有限稀释法制备稳定分泌抗ChIL-4 mAb细胞株;采用间接ELISA、间接免疫荧光法(IFA)以及Western blot法分析mAb的特异性。结果获得4株抗ChIL-4的mAb,分别命名为6A8、18F12、19F1、20G3,腹水mAb的ELISA效价为(1.6~6.4)×104;ELISA、IFA及Western blot结果显示该4株mAb均是特异针对重组ChIL-4的mAb,不具有识别重组牛IL-4、鸡γ干扰素(IFN-γ)等其他蛋白的能力。结论成功制备了抗ChIL-4的mAb。     

抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的: 研制抗李斯特菌溶血素(LLO)的单克隆抗体(mAb).方法: 通过诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX-6p-1-hly), 以SDS-PAGE分离菌体蛋白, 切割目的蛋白LLO-GST条带, 研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠, 取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合.利用亲和层析法纯化目的蛋白, 作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选.采用间接ELISA法测定腹水效价, Dot-ELISA、 Western blot分析mAb的特异性.结果: 获得3株稳定分泌抗LLO mAb的杂交瘤细胞株3B6、 4D1、 5D10, 其Ig亚类均为IgG1.3B6、 4D1、 5D10腹水的ELISA效价分别为1:2×105、 1:2×105、 1∶1×105.Western blot试验中, 3株mAb均能与融合蛋白LLO-GST发生反应出现特异性条带, 而与纯化蛋白GST不反应.在Dot-ELISA试验中, 3株mAb均能与表达LLO的细菌发生特异性反应.结果表明, mAb 3B6、 4D1、 5D10是针对LLO的特异性mAb.结论: 成功地制备了抗LLO的mAb, 为进一步研究LLO的生物学特性、产单核细胞李斯特菌的致病机制, 以及建立产单核细胞李斯特菌(LM)快速检测技术奠定了基础.     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

牛肿瘤坏死因子α小鼠单克隆抗体的制备

目的制备抗牛肿瘤坏死因子α(BoTNF-α)的单克隆抗体(mAb)。方法以原核系统表达的带有组蛋白(His)标签的重组牛TNF-α蛋白(rHis-BoTNF-α)为免疫原,带有谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签的重组牛TNF-α蛋白(rGST-BoTNF-α)为检测原,采用杂交瘤细胞技术制备mAb。Western blot法检测mAb与rHis-BoTNF-α和rGST-BoTNF-α的反应性,间接ELISA检测mAb效价、特异性以及mAb与商品化重组BoTNF-α的反应性,流式细胞术分析mAb识别天然抗原的活性。结果成功筛选出7株稳定分泌抗rBoTNF-αmAb的杂交瘤细胞株。结果证明7株mAb均具有良好的反应性及特异性。流式细胞术分析显示mAb 4G4具有良好的识别天然抗原的活性。结论成功制备了抗BoTNF-α的mAb。     

人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗精子蛋白17(Sp17)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:克隆人Sp17cDNA,表达带有6His标记的重组Sp17,用纯化的重组Sp17免疫BALB/c小鼠制备mAb。用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆。用免疫组化染色法及阻断试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系3C12和3D6,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。用人和大鼠睾丸组织以及人精液精子免疫组化染色及阻断试验证明,抗Sp17mAb具有良好的特异性。抗Sp17mAb也可识别卵巢癌组织中异常表达的Sp17。结论:成功地制备特异性的抗Sp17mAb,为研究该蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。     

鸡痘病毒ORF214原核表达蛋白单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的:经发表的鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)ORF214基因序列,利用PCR方法扩增出目的片段,测序后并克隆至原核表达载体pET-28a,用表达产物制备抗FPVORF214蛋白单克隆抗体(mAb)。方法:以鸡痘病毒ORF214原核表达蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,用间接ELISA方法检测筛选。结果:阳性细胞株经3代克隆纯化后,获得3株能稳定分泌抗FPVORF214蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2F10C9、3C3B10、2G8G7。3株杂交瘤细胞分泌的抗体均能够特异地与FPVORF214蛋白反应,细胞上清ELISA效价均在1×102以上,mAb腹水效价达1×104以上。结论:该特异性mAb的研制成功为进一步研究ORF214的生物学特性奠定基础。     

AsiaⅠ口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果:成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株,分别命名为:1B8、5E1、5E2,其分泌的mAb为IgG1(1B8)和IgG2a(5E1、5E2)亚类,他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒,其腹水效价在1:105～1:106。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV,中和效价达1:1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性,型间无交叉反应,证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论:在口蹄疫病毒mAb的研究中,VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1mAb的成功制备,为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

抗人硫氧还蛋白-1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用

目的:制备抗硫氧还蛋白-1(TRX-1)的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:以原核表达的TRX-1为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合.采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析,用Western blot法对mAb的特异性进行鉴定.结果:得到筛选出3株能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株B6、D5和E3,免疫球蛋白亚类均为IgG>(к),腹水mAb效价均在106以上,3株抗体分别针对不同抗原表位.用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22 μg/L.结论:获得3株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株,为研究TRX-1在人类细胞、血液、组织中的表达及定位提供了可能,并为探索相关炎症、癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具.     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体（mAb）并进行鉴定。方法：用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB／c小鼠，经过3次免疫后，取其脾细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果：成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株，分别命名为：188、5E1、5E2，其分泌的mAb为IgG1（188）和IgG2a（5E1、5E2）亚类，他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒，其腹水效价在1：10^5～1：10^6。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV，中和效价达1：1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性，型间无交叉反应，证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论：在口蹄疫病毒mAb的研究中，VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1 mAb的成功制备，为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

抗艰难梭菌A毒素单克隆抗体的制备及特性分析

目的 :制备抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体 (mAb)并鉴定其特性。方法 :用纯化的艰难梭菌A毒素免疫BALB/c小鼠 ,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2 / 0融合 ,采用间接ELISA筛选杂交瘤细胞。用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析 ;用Westernblot检测mAb的特异性。结果 :得到 6株杂交瘤细胞株 ,5C10株细胞分泌的mAb为IgG2a ,4B5和 8A1株细胞分泌的mAb为IgG1,其他 3株细胞mAb (2H7、3E9和 6G8)均分泌IgM。中和试验表明 ,所有的mAb均无中和活性。腹水mAb的效价均在 10 -4以上 ,其中mAb 2H7、6G8、5C10、4B5和 8A1具有共同的表位 ,而mAb 3E9识别的位点与其他 5株不同。mAb 8A1和 4B5的相对亲和力>10 5,其他 4株mAb的相对亲和力 >10 4。在非变性条件下 ,PAGE后Westernblot的结果显示 ,6株mAb均可与相对分子质量 (Mr)为 5 5× 10 4的A毒素产生反应 ;而在变性条件下 ,还原与非还原SDS PAGE后Westernblot均显示 ,6株mAb均可与Mr 为 5× 10 4～ 2 4× 10 4的A毒素产生反应。结论 :6株杂交瘤细胞株均能分泌抗艰难梭菌A毒素的特异性mAb ,为艰难梭菌A毒素的研究提供了有利的工具     

抗PSMA 膜外域单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗PSMA膜外域单克隆抗体。方法:应用生物信息技术预测PSMA膜外域多肽抗原片段,原核表达,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗PSMA膜外域单克隆抗体,亲和层析纯化和Western blot及ELISA鉴定,并用于前列腺癌动物模型放射免疫显像。结果:经软件分析,获得含310aa序列特异性强的膜外域抗原片段,免疫、融合后,经过ELISA筛选获得到3株阳性杂交瘤细胞株(5E6、4A5和4D7),亚型鉴定结果为5E6、4A5为Ig G2a,4D7为Ig G1,腹水型抗体效价均在1∶256 000以上;Western blot结果表明,所制备的单克隆抗体均可与PSMA膜外域抗原特异性结合,竞争抑制ELISA试验显示制备的单抗与重组抗原及标准抗原PSMA能竞争结合。动物模型放射免疫显像结果进一步证实,制备的单克隆抗体在动物体内能与PSMA膜外域抗原特异性结合,并使肿瘤显像。结论:制备的抗PSMA膜外域单克隆抗体能特异性识别PSMA抗原,为前列腺癌的免疫诊断及免疫治疗奠定了基础。     

抗ICAM-1单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备有生物学活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:以纯品ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠4次。采用杂交瘤技术,经3次亚克隆筛选稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株。采用动物体内诱生的方法大量制备mAb。以protein G对其进行纯化后,用间接ELISA法测定mAb的效价并鉴定其Ig亚类。用Western blot鉴定mAb的特异性。结果:筛选出4株可稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为B9株、F1株、C11株和D6株。4株mAb的Ig亚类均为IgG1。4株mAb培养上清的效价均为1∶1 000;腹水的效价B9株与D6株为1∶2×105,F1株与C11株为1∶4×105。纯化后mAb的蛋白浓度为1.2 g/L,均可与ICAM-1特异性结合。结论:成功制备出效价高、特异性良好的4株抗ICAM-1 mAb,为进一步研究ICAM-1的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

抗2型登革病毒M蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的 克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因片段,在pET-32a(+)表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用于免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力.结果 获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6和Ⅲ3D2;相对亲和力均在105 以上.Westernblot显示2株mAb能特异识别重组M蛋白.结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒M蛋白的2株mAb,为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具.     

抗温和气单胞菌单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗温和气单胞菌(Aeromonassobria,As)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以灭活的温和气单胞菌免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备抗温和气单胞菌mAb。用间接ELISA法对mAb的特性进行初步鉴定。结果获得6株能稳定分泌抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A8、2A8、2F11、3C6、3D11、4G2。经测定杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水mAb效价分别为1×10-2~1×10-3、1×10-5~1×10-6。6株杂交瘤细胞系所分泌的mAb亚类是2A8、2F11为IgG1,1A8、3D11为IgG2a,3C6为IgG2b,4G2为IgG3。其中mAb3C6经交叉反应试验证明,与弧菌属其他几种细菌均不起反应,特异性强。结论成功地制备了抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株,为该病的免疫学诊断及防治提供了基础。     

抗百日咳毒素单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的：制备抗百日咳毒素（PT）的单克隆抗体（mAb）。方法：按常规细胞融合技术制备抗PT的mAb，并对其特异性、相对亲和力及中和活性等进行了鉴定。结果：获得7株分泌抗PT的mAb的杂交瘤细胞。7株mAb的Ig亚类（型）均为1gG1（κ），并能特异性识别PT，与百日咳丝状血凝素及C型肠毒素无交叉反应。其中2侏mAb 1D4和3E4有中和抑制PT聚集CHO细胞的活性。Western blot的结果表明，2D7、5F9、5F8、1D4和2C25株mAb，均能识别PT抗原的S1亚单位蛋白，mAb 1B8可识别S2亚单位蛋白，mAb 3E4可识别S3亚单位蛋白。结论：成功地制备抗PT的mAb，经鉴定具有良好的特异性，为研制定量检测PT的ELISA试剂盒提供了制剂，