Ferumoxides标记神经干细胞及其对增殖分化的影响

目的:研究超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxides.SPIOs)标记神经干细胞及其生物学特性.方法:神经干细胞培养、传代和诱导分化;菲立磁(Ferumoxides,一种SPIOs)标记神经干细胞,制备磁标记神经干细胞;利用免疫细胞化学、透射电镜和Prussian blue染色等方法对磁标记神经干细胞的生长、分化等生物学特性进行研究.结果:在原代及传代细胞中有Nestin阳性细胞即神经干细胞.血清诱导下,神经干细胞可分化为GFAP、MAP-2、NSE、Tau蛋白及NF200阳性细胞.Ferumoxides与神经干细胞共同孵育后,透射电镜及Prussian blue染色显示胞浆中含有铁颗粒,SPIOs也可以随细胞的分裂增殖而传到子代细胞中.随Ferumoxides浓度的增高(2.8μg/ml～16.8μg/ml),Ferumoxides对神经干细胞存活、分化能力的影响无显著性差异(P＞0.05).当Ferumoxides的浓度大于22.4μg/ml时,SPIOs影响其存活和分化(P＜0.05).结论:本实验在国内首次利用Ferumoxides作为磁标记探针,对神经干细胞进行成功磁标记.为进一步利用核磁共振(MRI)对神经干细胞活体追踪奠定实验基础.     

Feridex及Resovist对神经干细胞生物学特性影响的实验研究

目的研究超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxides,SPIOs)Feridex及Resovist对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)生物学特性的影响。方法 NSCs培养及鉴定;使用Feridex及Resovist制备磁标记NSCs;利用免疫细胞化学、透射电镜和Prussian blue染色等方法对磁标记NSCs的生长、分化等生物学特性进行研究。结果 Feridex及Resovist分别与NSCs共同孵育后,透射电镜及Prussian blue染色显示胞浆中含有铁颗粒,SPIOs也可以随细胞的分裂增殖而传到子代细胞中。随Feridex及Resovist浓度的增高(2.8μg/mL～16.8μg/mL),Feridex及Resovist对NSCs存活、分化能力的影响无显著性差异(P>0.05)。当Feridex及Resovist的浓度大于22.4μg/mL时,SPIOs影响其存活和分化(P<0.05),在同一浓度条件下,Feridex和Resovist对NSCs的影响无显著性差异(P>0.05)。结论低浓度(<22.4μg/mL)的Feridex及Resovist对NSCs生物学特性无明显影响。     

磁探针标记乳腺癌干细胞的实验研究

目的 研究超顺磁性氧化铁(superparamgnetic iron oxides,SPIOs) 标记乳腺癌干细胞及其生物学特性.方法 乳腺癌干细胞分离、鉴定及培养;用Feridex(一种SPIOs)标记乳腺癌干细胞,制备磁标记乳腺癌干细胞;利用MTT、透射电镜和Prussian blue染色等方法对磁标记的乳腺癌干细胞生物学特性进行研究.结果 在原代培养的乳腺癌细胞中分离出乳腺癌干细胞.Feridex与乳腺癌干细胞共同孵育后,Prussian blue染色及透射电镜均显示乳腺癌干细胞胞浆中含有氧化铁颗粒.随Feridex浓度的增高(15～25μg/mL),Feridex对乳腺癌干细胞存活、繁殖能力的影响差异无统计学意义(P>0.05).当Feridex的浓度大于35μg/mL时,影响其存活和繁殖(P<0.05).结论 本实验利用Feridex作为磁标记探针,对乳腺癌干细胞进行成功磁标记,为进一步利用核磁共振(MRI)对乳腺癌干细胞活体追踪奠定实验基础.     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

超顺磁性氧化铁标记的骨髓单个核细胞在急性心肌梗死环境中的分化研究

目的 初步探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIOs)标记的猪骨髓单个核细胞(BM-MNCs)在急性心梗环境中向心肌样细胞分化的能力.方法 分离培养猪BM-MNCs,SPIOs标记,制备猪急性心梗模型,1周后经冠状动脉植入SPIOs标记的BM-MNCs,4周后行MILI示踪定位,心肌组织切片,利用Prussian blue染色、免疫组化、透视电镜及病理图文分析系统对标记细胞的分化行为进行研究.结果 4周后实验组心肌梗死周边区MRI可检测到点片状模糊低信号区(T2WI),Prussian blue染色及透视电镜显示胞浆中舍有铁粒子,免疫组化提示标记细胞结蛋白(Desmin)、肌球蛋白重链(MHC)表达阳性,同时CD68表达阴性,病理图文定量分析显示实验组梗死周边区结蛋白、肌球蛋白重链表达较对照组有所增加,差别具有显著性(P＜0.05).结论 SPIOs标记的BM-MNCs在急性心梗环境中仍具备向心肌样细胞分化的能力.     

超顺磁性氧化铁对大鼠神经干细胞生物学活性的影响

目的 初步研究利用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓基质细胞来源的神经干细胞及其对细胞活力、增殖等生物学活性的影响,并确定最佳标记浓度.方法 无菌条件下取大鼠股骨骨髓,梯度密度离心法分离得到骨髓基质细胞.体外培养、诱导成神经干细胞,使用不同终浓度的(6.25、12.5、25、37.5、50μg/ml)Ferumoxides(超顺磁性氧化铁)标记神经干细胞,采用普鲁士蓝染色、MTT法、流式细胞仪、透射电镜等方法鉴定Ferumoxides标记神经干细胞的效率及对细胞活力、增殖等生物学特性的影响.结果 Ferumoxides可以高效率标记神经干细胞,标记效率在90%以上.普鲁士蓝染色显示标记的神经干细胞胞质内存在细小蓝色铁颗粒,细胞呈淡蓝至深蓝色,颜色的深浅与所加Ferumoxides的剂量成正相关.电镜结果显示标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,主要集中在胞体上.当Ferumoxides终浓度高于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒在细胞内聚集成团块状,量较多,在一定程度上影响了细胞超微结构的观察;低于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒散布于细胞胞质内,并随着浓度的降低,Ferumoxides颗粒在胞质内分布越分散,量越少.MTT及流式细胞仪结果显示Ferumoxides终浓度大于25 μg/ml时则对细胞活力、增殖、凋亡有一定影响,小于等于25 μg/ml时对细胞活力、增殖无明显影响.结论 利用Ferumoxides在体外标记神经干细胞是一种可行的实验方案,其最佳终浓度为25 μg/ml.     

昆明小鼠胚胎干细胞大鼠侧脑室内移植诱导分化的在体研究

目的：探讨脑内微环境诱导胚胎干细胞向神经细胞分化的状况，确定胚胎干细胞脑内移植的最佳分化阶段。方法：将未分化的昆明小鼠胚胎干细胞和经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞分别进行侧脑室内移植，通过苏木素伊红（HE）染色、尼氏染色和神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色，检测胚胎干细胞移植后的存活和分化情况。结果：未分化的昆明小鼠胚胎干细胞侧脑室内移植后．不能很好地向神经细胞方向分化，有形成畸胎瘤的倾向。而经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞进行侧脑室移植后4周，移植物中有相当一部分细胞为NSE免疫阳性细胞．部分细胞的胞浆中可见尼氏小体。具有神经细胞的典型特征。结论：经过维甲酸诱导后，胚胎干细胞发生了向神经细胞的分化．在侧脑室微环境中可以存活．并朝着神经细胞方向分化。     

GM-1对培养的人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的：观察不同剂量神经节苷脂（GM－1）对神经干细胞增殖和分化的影响。方法：从人胚胎脑组织分离出神经干细胞，培养于含bFGF（阳性对照组）和B27（阴性对照组）的DMEM／F12细胞培养液中，实验组培养液中分别加入0．335μg/L，3．35μg/L及33．5μg/L的GM－1，用MTT比色分析法测定细胞增殖能力，用含体积分数3％血清的DMEM／F12培养液诱导细胞分化，每间隔6h于倒置显微镜下观察细胞分化情况，结果：5d,10dMTT比色显示，GM－1（33．5μg/L）组与阳性对照组比较，P均＞0．05，与阴性对照组比较，P均＜0．05，GM－1（0．335μg/L）组，GM－1（3．35μg/L）组与阴性对照组比较，P均＞0．05。分化实验发现，接种6h后，体积分数3％血清＋DMEM／F12组神球周边可见明显的细胞突起，呈放射状向周围伸出，而3个实验组和阴性对照组的细胞突起短且细小，随着培养时间的延长，各组的细胞突起逐渐伸长，3个实验组分化能力低于对照组，与阴性对照组之间无明显差异，结论：GM－1能够维持神经干细胞的原始神经状态，促进神经干细胞的增殖，对神经干细胞无明显的诱导分化作用。     

采用形态学实验研究双脱甲氧基姜黄素对人血管内皮细胞的诱导凋亡作用

目的：探讨双脱甲氧基姜黄素（又称姜黄素－3）对人肺微血管内皮细胞的诱导凋亡作用。方法：（1）采用Giemsa染色法观察浓度分别为4μg/ml、8μg/ml和12μg/ml的双脱甲氧基姜黄素诱导内皮细胞凋亡的效果；（2）采用透射电镜观察浓度分别为4μg/ml、8μg/ml的双脱甲氧基黄素诱导内皮细胞凋亡的效果；（3）采用丫啶橙荧光染色观察内皮细胞在8μg/ml双脱甲氧基姜黄素诱发凋亡后发生的形态结构改变。结果：（1）Giemsa染色实验表明，双脱甲氧基姜黄素作用24h后，4μg/ml组细胞凋亡率为15．8％，与阴性对照组（13．2％）比较无明显差异（P＞0．05），8μg/ml组和12μg/ml组细胞凋亡率分别为20．6％和38％，与阴性组比较差异显著（P＜0．01和P＜0．001），凋亡细胞多表现为胞体缩小、变圆，核浓缩，呈紫黑色；（2）透射电镜分析表明，4μg/ml组的内皮细胞形态结构与阴性对照组基本相同，无明显异常改变，8μg/ml组有大量凋亡小体形成，并观察到较多的典型凋亡细胞；（3）丫啶橙荧光染色可较细致地显示细胞凋亡时的多种结构、形态改变，能够发现较早期的凋亡细胞，因而其敏感度可能更高。结论：（1）双脱甲氧基姜黄素诱导内皮细胞凋亡作用的有效剂量为8μg/ml；（2）丫啶橙荧光染色是研究细胞凋亡的一种较好的形态学实验方法，同时也适于定量分析。     

龟板提取物诱导神经干细胞向神经元分化过程中相关microRNA表达变化

【目的】观察龟板提取物诱导神经干细胞（neural stem cells, NSCs）向神经元细胞定向分化过程中相关microRNA表达的变化。【方法】分离培养孕14 d SD胎鼠原代神经干细胞,经免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特异抗原及其多向分化能力。神经干细胞随机设空白对照组、龟板提取物低浓度组（3μg/mL）、龟板提取物高浓度组（30μg/mL）。诱导分化7 d,提取各组细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测不同组别miR-124和miR-9的变化。【结果】与空白对照组比较,龟板提取物低浓度组miR-124和miR-9表达均无显著变化,龟板提取物高浓度组均显著升高（P<0．05）。【结论】龟板提取物可能通过调控miR-124、 miR-9表达在NSCs向神经元细胞定向分化过程中起重要作用。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

体外诱导细胞转化为胰岛细胞的研究进展

巢素蛋白（nestin）阳性细胞、成体干细胞（包括间充质干细胞和胰腺导管上皮细胞）和胚胎干细胞是常用的体外诱导转化为胰岛细胞的种子细胞,本文就这三类细胞的来源、实验方法及实验结果的研究进展进行综述。     

外源性褪黑激素对小鼠生精细胞凋亡的影响

目的 观察褪黑激素对生精细胞凋亡的影响。方法 HE染色、TUNEL测定(核快红复染)。结果 HE染色下睾丸间质细胞的面积随褪黑激素的增多而减小,与睾酮的浓度变化相一致。TUNEL阳性细胞随褪黑激素的增加有增多的趋势,但超过一定量后(100ug),不再增多。20～30d的处理组呈现与30～40d的处理组不同的结果。结论 外源性褪黑激素具有促进生精细胞凋亡的作用。这种作用与其对睾酮的抑制作用不相一致。     

大鼠肝星状细胞的分离培养鉴定

目的改良分离培养大鼠肝星状细胞的简便方法。方法经过门静脉插管、推注肝素稀释液、肝脏灌流、胶原酶离体循环消化、过滤、离心分离等步骤,分离肝星状细胞,省去了链霉蛋白酶E消化过程,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果每只鼠肝HSCs的得率为0.5~1.0×107,纯度为(92.2±2.0)%,活率为(97.8±0.3)%,数量及活率均符合实验要求。结论该方法简便、廉价、实用,值得进一步探索。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

Mechanism of in Vitro Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells into Neuron-like Cells

Marrowstromalcells (MSCs)arethenon hematopoieticprecursorsinthebonemarrowstromaofadultmammal.Underspecificexperimentalcondi tions,itcandifferentiateintoneuron[1] .Thephe nomenonhasgivenresearchersagreatsurprise .Andnow ,thehotspotistofinditstrueevidence ,…     

肝癌干细胞的研究进展

肿瘤干细胞(CSC)假说是近年来提出的关于肿瘤发生的新理论,该学说认为不是所有的细胞都能突变发育成肿瘤,只有一部分特殊的细胞能够发育成肿瘤,并维持肿瘤的生物学特性。过去几年内研究者已经证明包括肝癌在内的许多CSCs的存在,并分别针对肝癌干细胞与肝癌的关系、肝癌干细胞的生物学特性和鉴定标志等问题展开讨论,总结了一些治疗措施。现对CSCs及肝癌干细胞的研究进展予以综述。