单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对人骨肉瘤细胞杀伤作用的研究

目的:观察单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)基因治疗系统对骨肉瘤细胞株OS732的杀伤作用并研究其作用机制。方法:构建含HyTK基因的逆转录病毒载体DORHyTK,用DOTAP将其转入骨肉瘤细胞株OS732;提取阳性转染细胞(OS732TK)的DNA和总RNA,分别用PCR和斑点杂交的方法检测转染的效果;用MTT比色法测定OS732TK对GCV的敏感性及旁观者效应;Hoeschst332258染色,电镜和流式细胞仪分析HSV-TK/GCV系统对OS732TK细胞杀伤作用的机制。结果:成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK。OS732TK细胞整合了TK基因并有稳定的转录产物。5mg/LGCV作用5d即可杀伤所有OS732TK细胞。旁观者效应在高、低两种细胞密度接种条件下均存在,且前者强于后者。Hoeschst332258染色及电镜均显示典型的细胞凋亡特征,但也有少量坏死细胞的存在。流式细胞仪分析的结果说明在GCV作用下,OS732TK细胞阻滞于细胞周期的G₀-G₁期。结论:HSV-TK/GCV基因治疗系统对骨肉瘤细胞株OS732有很强的杀伤作用,且存在明显旁观者效应。此系统导致了OS732细胞周期的紊乱,引起细胞的凋亡和坏死。HSV-TK/GCV基因治疗系统为骨肉瘤的治疗提供新的思路。     

骨肉瘤血管生成与肿瘤治疗的实验研究

目的：研究人骨肉瘤OS－732细胞系促进血管生成作用及血管内皮生长因子（VEGF）抗体对其血管生成的抑制作用。方法：应用鸡胚绒毛尿囊膜模型。通过解剖显微镜、光镜及免疫组化方法观察人骨肉瘤OS－732细胞系血管生成活性，并探讨VEGF抗体的血管生成抑制作用。结果：OS－732细胞系具有较强的促血管生成能力，鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤组织中VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）均呈阳性表达，且VEGF呈持续高表达。给予VEGF抗体后VEGF抗体组血管数目、瘤细胞数低于PBS对照组。结论：VEGF、bFGF、TGF-β1可能共同参与骨肉瘤OS－732细胞系诱导的血管生成，其中VEGF可能起着主要作用。VEGF抗体能抑制本细胞系的血管生成，提示VEGF抗体对骨肉瘤治疗具有良好的应用前景。     

原丝蛋白对细胞在软琼脂中集落形成的影响

本研究采用原丝蛋白基因低表达的小鼠乳癌温度敏感变异株tsFT101细胞及野生株FM3A细胞，探讨原丝蛋白对细胞在软琼脂中集落形成的影响。应用Lipofection方法向tsFT101细胞内导入原丝蛋白表达基因，使用Northern blot方法检测各细胞株原丝蛋白mRNA表达水平，观察各细胞株在软琼脂中的集落形成情况。结果可见原丝蛋白mRNA表达水平由高至低的顺序是FM3A细胞、经基因转染的tsFT101细胞及未做处理的tsFT101细胞。在0．33％软琼脂中形成的集落大小与此顺序相对应。结果表明，原丝蛋白的表达水平降低能减弱细胞在软琼脂中集落形成的能力。     

人多梳蛋白2不同功能片段真核表达载体的构建及表达

目的:构建HPC2不同截短功能片段的真核表达载体,并检测各片段在骨肉瘤U2OS细胞中的表达。方法:以质粒pcDNA3.2-V5/HPC2为模板,分别设计各片段PCR引物进行扩增,EcoR I酶切鉴定PCR产物,正确的PCR产物进行连接后转化到DH5α感受态细胞中并涂板筛选,从而得到带有V5标签的不同截短动能片段的表达载体,提取质粒并转染U2OS细胞,Western blot法鉴定目标蛋白的表达。结果:测序及酶切的结果均表明HPC2不同功能片段的真核表达载体构建成功,并能够在U2OS细胞中表达。结论:成功构建了HPC2不同功能域片段的真核表达载体。     

反义Id基因转染HT29细胞后TGF─α、βmRNA表达的研究

为了探讨Ｉｄ基因的反义核酸对ＨＴ２９细胞生长和增殖的作用。本研究用反义Ｉｄ基因转染人结肠癌细胞株ＨＴ２９细胞后，发现ＨＴ２９细胞的生长受到抑制，３Ｈ－ＴｄＲ掺入率及软琼脂集落形成能力明显降低，ＴＧＦ－αｍＲＮＡ表达降低，而ＴＧＦ－βｍＲＮＡ升高。上述结果初步表明，Ｉｄ基因的反义核酸可抑制ＨＴ２９细胞的生长和增殖，为结直肠癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径，ＴＧＦ－α、βｍＲＮＡ在转染后表达变化的相互关系尚有待进一步探讨     

抑制survivin基因的表达对骨肉瘤细胞株U-2OS凋亡的影响

目的：观察抑制survivin基因表达后对骨肉瘤细胞株U-2OS凋亡的影响。方法：下调骨肉瘤细胞株U-2OS中survivin的表达，并采用免疫印迹法(western blot)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测U-2OS细胞株中survivin的蛋白和mRNA表达；同时采用甲基偶氮哇盐(MTT)法、流式细胞术和western blot检测下调survinin对化疗药物顺铂增加细胞凋亡和减少存活率作用的影响，并探讨其对抗凋亡分子Bcl-2以及促凋亡分子Bax的蛋白表达的作用。结果：survivin-siRNA成功转染U-2OS细胞株后，western blot和RT-PCR检测结果均显示U-2OS细胞株中survivin的蛋白和mRNA表达水平显著低于空白对照组(P<0.05)；MTT比色法结果显示下调survivin可促进化疗药物顺铂对U-2OS细胞株存活率降低及生长抑制率增加的作用；western blotting检测结果表明，与空白对照组相比，Bcl-2的蛋白表达显著减少(P<0.05)，而Bax的蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论：下调survivin基因表达可促进骨肉瘤U-2OS细胞株的凋亡，并增加其对化疗药物顺铂的敏感性，为以survivin作为靶基因治疗骨肉瘤提供实验依据。     

单纯疱疹病毒胸苷激素酶基因在骨肉瘤细胞中的表达和作用

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－TK）及其底物丙氧乌苷（GCV）的基因治疗系统对骨肉瘤细胞株SAOS－2的杀伤作用。方法：用DOTAP将含有HSV－TK基因的真核表达质粒tgCMV-HyTK导骨肉瘤细胞株SAOS－2;提取阳性转染细胞（SAOS－2TK）的总RNA,用斑点杂交的方法检测HSV－TK基因的表达;用MTT比色法测定SAOS－2TK细胞对GCV的敏感性及“旁观者效应”。结果：SAOS－2TK细胞能产生稳定的TK基因的转录物;SAOS－2TK细胞在GCV的作用下呈现明显的生长抑制效应,且观察到强效的“旁观者效应”。结论：HSV－TK／GCV系统能够选择性杀死骨瘤细胞。     

应用抑制性消减杂交技术鉴定肿瘤转移抑制相关基因

目的 克隆与肿瘤转移抑制相关的基因，探讨成骨肉瘤转移的分子机理。方法 采用抑制性消减杂交技术构建了人成骨肉瘤低转移细胞株SOSP－9607的消减文库，对部分克隆进行了测序和同源性分析，用Northern杂交及后转录PCR技术证实了克隆的表达情况。结果 在低转移细胞株SOSP－9607中高表达的克隆中有2个克隆与人端粒结合因子2（telomeric repeat binding factor 2,TERF2)同源。Northern杂交及反转录PCR证实这个基因只在低转移细胞中表达，而在高转移人成骨肉瘤细胞株SOSP－M和裸鼠肺转移结节中均未表达。结论 TERF2可能在维持肿瘤细胞自身相对稳定、抑制骨肉瘤演进中起重要作用。     

下调HMGA2基因表达对改善骨肉瘤U2OS细胞恶性表型的实验研究

目的:研究HMGA2表达在维持人骨肉瘤U2OS细胞恶性表型中的作用,为基因靶向治疗提供理论依据。方法:采用基于DNA的shRNA表达载体HMGA2-shRNA,稳定转染人骨肉瘤U2OS细胞,下调其HMGA2表达水平,并应用RT-PCR技术检测其对HMGA2基因的沉默效果;经Cell Counting Kit-8(CCK8)测定、Hoechst33342染色荧光显微镜观察及Boyden小室法分别检测细胞增殖、凋亡及迁移情况;实时定量RT-PCR检测mRNAs表达水平。结果:稳定转染靶向HMGA2的shRNA可特异性下调U2OS细胞HMGA2 mRNA表达水平;其作用结果使细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制,自发凋亡率及Caspase 3和Caspas 9基因表达水平显著升高。结论:HMGA2基因异常表达在维持人骨肉瘤U2OS细胞恶性表型中起重要作用,靶向HM-GA2的基因治疗可能为骨肉瘤治疗带来新希望。     

探讨高表达肿瘤抗原基因OVA66对WISH细胞生物学特征的影响

目的 分析转染OVA66基因WISH细胞的生物学特征变化,探讨该基因的功能.方法 采用脂质体方法将重组真核表达载体pcDNA3.1-OVA66转染正常人羊膜细胞系WISH,经G418稳定筛选、克隆和扩增.采用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光等方法检测目的基因及其蛋白的表达,通过电镜分析细胞超微结构,体外侵袭实验检测细胞生长特性和侵袭能力, 软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆性生长能力,并应用基因芯片技术检测相关基因差异表达.结果 RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1-OVA66细胞OVA66基因呈高表达;Western bloting显示OVA66蛋白处出现明显的条带;电镜检测表明该基因可明显增强WISH细胞增殖能力;体外侵袭实验显示,该基因可增强WISH细胞的侵袭转移能力;软琼脂克隆形成实验表明OVA66基因可以促进单克隆性生长能力;基因芯片提示,该基因高表达影响某些基因的异常表达.结论 提示OVA66基因高表达可促进细胞的增殖,利于肿瘤的侵袭和转移.     

p16INK4A和 p15INK4B对人肝癌细胞增殖和凋亡影响的研究

目的　为探讨抑癌基因 p16 INK4 A和 p15 INK4 B对 Rb基因状态不同的人肝癌细胞系增殖和凋亡的影响。方法　在分析细胞系遗传背景鉴定基础上采用脂质体将构建的 p XJ- p16、p XJ- p15重组质粒转染人肝癌细胞系 BEL74 0 2 (p16 / p15 Rb )和 SMMC772 1(p16 / p15 / Rb- )。应用 PCR、RNA斑点印迹、MTT、集落形成、流式细胞仪等技术检测外源性 p16和 p15基因、m RNA表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。结果　经转染的 BEL74 0 2 - p16 ,BEL74 0 2 - p15细胞 ,分别存在外源性 p16、p15基因 ,在含外源基因细胞中相应的 m RNA表达增强 ;BEL74 0 2 - p15细胞生长速度、集落形成率显著低于对照细胞 BEL 74 0 2 (P<0 .0 1) ;细胞周期分析观察到与亲本细胞比较 ,BEL 74 0 2 - p15的 G1期细胞由 37.7%增高到 4 3.6 % ,S期细胞由 2 2 %下降到 13% (P<0 .0 5 ) ,并出现 G1亚峰 (凋亡峰 )。与此相反 ,BEL74 0 2 - p16细胞增殖未见抑制 ,细胞周期分布无明显差异 ,集落形成率也未见减少。此外 ,SMMC772 1- p16细胞增殖也无抑制。结论　外源性 p15 INK4 B具有抑制人肝癌细胞生长 ,诱导细胞凋亡的作用 ,其作用不受内源性p15影响。而 p16 INK4 A对肝癌细胞生长抑制的作用可能依赖于 RB途径的完整性。     

表达人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子逆转录病毒载体的构建

构建了ｈＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ逆转录病毒载体，将其分别转染甲胎蛋白表达阳性和阴性的肝癌细胞系Ｈｕ－Ｈ７和ＨＬＥ。结果，ｈＧＭ－ＣＳＦ在两种人肝癌细胞系中有表达。表达产物能分泌到肝癌细胞外，分泌到细胞的产物用ＴＦ－１细胞检测证明具有生物学活性。     

MTS1／p16抑制基因的克隆及其对宫颈癌细胞系的影响

利用重组ＲＴ－ＰＣＲ方法从人胎盘中扩增多重肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）全长ｃＤＮＡ片断，克隆测序后，亚顾隆入哺乳动物高铲表达质粒ｐＣＥＰ中。将表达质业转染两种遗传背影不同的吕颈癌细胞系，发现外源基因ＭＴＳ１／ｐ１６基因的导入对ＨＰ〖Ｖ阳性的宫颈癌细胞系具有明显生长抑制作用，并出现细胞滞留Ｇ１期的特性。     

白血病细胞TGF-β1含量减少及外源性TGF-β1基因对HL-60细胞的作用

目的：研究白血病细胞是否存在转化生长因子β1（TGF-β1）量的异常以及这种异常在白血病发病机制中的可能作用。 方法： 应用ELISA法检测白血病细胞株和原代白血病细胞培养上清TGF-β1水平，进一步应用脂质体介导基因转移法将TGF-β1基因转染HL-60细胞，采用有限稀释法及G418筛选得到抗性细胞，应用RT-PCR、白血病细胞集落培养、裸鼠移植瘤成瘤试验、片段化DNA分析、流式细胞术检测HL-60细胞内TGF-β1、bcl-2、端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的表达变化等方法了解外源性TGF-β1基因对HL-60细胞体内外增殖、凋亡的影响。 结果： 白血病细胞株和原代白血病细胞培养上清TGF-β1水平明显低于正常对照组(P<0.01)，转染TGF-β1基因后，HL-60细胞内TGF-β1 mRNA表达上调，bcl-2、hTERT mRNA表达下调，细胞体外增殖受抑制，集落形成抑制率达78.3%，裸鼠移植瘤生长受抑制，荷瘤鼠生存期延长，细胞呈现凋亡特征性的梯形条带，凋亡比例达73.4%。 结论： 内源性TGF-β1水平降低是白血病的发病机制之一,外源性TGF-β1基因能够抑制HL-60细胞增殖，诱导细胞凋亡,该基因通过下调bcl-2、hTERT mRNA的表达而发挥作用。     

外源性Rb基因对U937细胞泡沫化过程中载脂蛋白B的影响

目的：研究Rb基因在U937细胞泡沫化过程中对细胞内载脂蛋白B含量的影响，初步探讨Rb基因在泡沫细胞形成过程中的作用。 方法： 采用氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）孵育U937细胞，以及Ox-LDL孵育同时导入外源性Rb基因转染U937细胞，分别于处理0 h、12 h、24 h收集细胞，半定量RT-PCR与流式细胞术检测Rb mRNA和蛋白的表达，流式细胞术检测细胞内载脂蛋白B的含量。平行实验重复3次，进行统计学方差分析。 结果： 氧化型低密度脂蛋白孵育U937细胞泡沫化过程中，12 h、24 h Rb基因的表达显著低于对照组0 h（P<0.05）；细胞内载脂蛋白B含量则显著高于对照组0 h（P<0.05）。而U937细胞在导入外源性Rb基因后，12 h、24 h细胞内的Rb基因的表达显著高于对照组0 h（P<0.05）；细胞内载脂蛋白B含量则显著低于对照组0 h（P<0.05）。 结论： 外源性Rb基因的导入可以下调细胞内载脂蛋白B的含量，表明Rb基因可能与单核细胞源性泡沫细胞形成有关，可能是影响泡沫细胞形成的相关基因的敏感候选基因之一。     

Nucleostemin基因在姜黄素抑制胃癌SGC-7901细胞增殖中的意义

目的探讨NS基因在姜黄素抑制胃癌SGC-7901细胞株增殖和诱导凋亡中的作用。方法不同浓度姜黄素作用于胃癌SGC-7901细胞株,利用MTT法检测细胞增殖抑制率,RT-PCR法检测姜黄素作用前后NS基因表达量的变化,流式细胞仪法检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果姜黄素能显著抑制体外培养的胃癌SGC-7901细胞株增殖,并呈量效和时效关系;流式细胞术显示G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,检出亚二倍体凋亡峰;RT-PCR显示NS基因表达量下降。结论姜黄素显著抑制胃癌SGC-7901细胞株增殖,并促进凋亡,其发生可能与NS基因表达下降有关。     

RACK1高表达促进人结肠癌细胞的生长和增殖

目的：研究RACK1高表达对人结肠癌细胞增殖能力的影响。方法：采用脂质体转染术分别建立 RACK1表达下调的SW620细胞系、RACK1表达上调的SW480细胞系以及对照细胞系;采用CCK-8细胞增殖测定、软琼脂集落形成实验、EdU掺入实验以及流式细胞术检测RACK1表达改变对 SW620和SW480细胞增殖的影响;采用Western blot分析RACK1表达改变对G1/S期限制点调控蛋白Cyclin D1和p27蛋白表达的影响。结果：下调RACK1的表达抑制SW620细胞的生长、软琼脂集落形成能力,降低EdU标记的S期细胞数目,阻滞细胞周期于G1/S期;而上调RACK1的表达增强 SW480细胞的生长、软琼脂集落形成能力,增加EdU标记的S期细胞数目,促进细胞周期G1/S期进程。结论：RACK1高表达促进人结肠癌细胞的生长和增殖。     

慢病毒载体介导2次转基因对人胚胎干细胞特性的影响

目的： 研究2次转基因对人胚胎干细胞（hESCs）多能分化特点和保持自我更新能力的影响。方法：构建携带非转录因子外源基因细胞毒性T细胞相关分子4免疫球蛋白 (CTLA4Ig) 、吲哚胺2,3双氧化酶（IDO）和荧光素酶的慢病毒载体,在hESCs先转导外源基因CTLA4Ig或IDO,完成筛选后转导外源基因荧光素酶。检测hESCs中外源基因的表达和功能,免疫组化和RT-PCR以及流式细胞仪方法检测hESCs细胞表面标记物、类胚体（EB）形成和体内畸胎瘤形成能力。结果：转导的外源基因均能表达并表现相应的功能。2次转导慢病毒载体后hESCs细胞表面标记物肿瘤排斥抗原（Tra-1-60） 和Octomer转录因子-4（OCT-4）染色仍为阳性,能形成EB,RT-PCR检测到甲胎蛋白(AFP)、配对盒基因6（Pax6）和MSI1的表达,异种移植后荧光信号逐渐增强。结论：利用慢病毒2次转导非转录因子外源基因不影响hESCs的未分化状态和多能分化能力,这对hESCs的转基因研究具有借鉴价值。     

LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法:应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区,利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA-LKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Western blot检测LKB1和STAT3在A549细胞中的表达变化。通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测获得性表达LKB1基因后肺癌细胞的增殖变化,流式细胞术(FCM)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果:成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系,与转染空白载体组比较,转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G1/G0期比例明显增加,S期比例减少,细胞凋亡率升高;同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。结论:LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。