Scopadulciol对胸腺激酶依赖的丙氧鸟苷阻断膀胱癌进展的增效作用

目的 观察Scopadulciol(SDC)在人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统对裸鼠膀胱癌的体内杀伤作用中的增效作用.方法 首先建立人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型,当肿瘤生长至直径约为6mm或体积为100 mm3时,随机分为4组,每组4只.A组为Ad-hTERT-HSV/tk+ GCV+ SDC组:于第1、5、10天每只裸鼠肿瘤内注射Ad-hTERT-HSV/tk(1×109 pfu)0.1 ml,第2天开始腹腔注射GCV(2.0 mg/d)×15 d和SDC(1 mg/d)×15 d.B组为Ad-hTERT-HSV/tk+ GCV组:注射Ad-hTERT-HSV/tk、GCV同A组.C组为Ad-hTERT-HSV/tk+ SDC组:注射Ad-hTERT-HSV/tk、SDC同A组.D组为对照组:裸鼠肿瘤内及腹腔内仅注射磷酸盐缓冲液(PBS).自注射药物开始,每7d用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤的体积,描绘肿瘤的生长曲线,共观察6周.另作4组治疗同上,2周后停止治疗,记录各组裸鼠的存活期,以观察对照组和治疗组存活期的改变.结果 单纯Ad-hTERT-tk/SDC(C组)及对照组(D组)对肿瘤生长无抑制或促进作用;而经过Ad-hTERT-tk/GCV治疗的B组裸鼠,显示出对肿瘤有抑制作用,其体积低于C、D组(P＜0.01),Ad-hTERT-HSV/tk/GCV+ SDC治疗的A组抑制肿瘤作用更为明显,比较B组有明显的增强作用,与B组比较差异有统计学意义(P＜0.01),与C、D两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).B、C、D各组荷瘤裸鼠的平均存活期分别为(54.0±3.2)、(50.2±3.0)和(49.7±3.7)d,而A组荷瘤裸鼠平均存活期延长至(73.0±5.6)d,与其余各照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Scopadulciol对胸腺激酶依赖的GCV阻断膀胱癌进展有一定的增效作用,将Scopadulciol与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk以及GCV联合应用于人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型的治疗,具有明显增效作用.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对膀胱癌体内杀伤作用的研究

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疤疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷(HSV-TK／GCV)系统对膀胱癌的体内杀伤作用。方法：用逆转录病毒载体感染鼠源性膀胱癌细胞株T739，体外观察其对GCV的敏感性。在鼠源性T739膀胱癌动物模型中，以逆转录病毒单次或重复感染方法介导TK基因转移，观察GCV治疗前后肿瘤体积大小及动物存活时间变化。结果：TK基因导入T739后获得了GCV敏感性，体内肿瘤生长受到抑制，动物存活时间延长，但单次和重复感染组之间无差别。结论：逆转录病毒成功介导膀胱癌体内基因转移，HSV-TK／GCV系统在体内对膀胱癌有杀伤作用，其可望对膀胱癌作为基因治疗。     

直接转导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对大肠肿瘤的杀伤作用

目的 通过单纯疱疹病毒胸苷酶（ＨＳＶ－ｔｋ）基因对荷大肠癌裸鼠肿瘤的直接转导及杀伤作用研究,建立有效的自杀基因抑制大肠肿瘤的治疗方法。方法 脂质体法将含ＨＳＶ－ｔｋ基因的逆转录病毒载体ＬＮｔｋ及空载体Ｇ１Ｎａ、ＰＡ３１７包装细胞中进行交叉包装、收获病上清。４０只ＢＡＬＢ／Ｃ裸鼠分成４组并皮下注射ＬｏＶｏ细胞成瘤,将含ｔｋ和Ｇ１Ｎａ的病毒上清分别直接注射到２组大肠肿瘤部位并予以腹腔注射３００ｍｇ／ｓ     

野甘草醇对胸腺激酶依赖的更昔洛韦阻断前列腺癌进展的增效作用

目的 观察野甘草醇(SDC)在人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)自杀基因系统对人前列腺癌细胞的杀伤作用中的增效作用.方法 测定胸苷激酶(TK)活性,应用高效液相色谱( HPLC)法测定三磷酸更昔洛韦(GCV-TP)在肿瘤细胞内的浓度,将不同配伍浓度的SDC、Ad-hTERT-HSV-tk、更昔洛韦(GCV)应用于前列腺癌细胞,观察体外对前列腺癌细胞的杀伤作用、旁杀伤效应.结果 SDC对转染Ad-hTERT-HSV-tk的LNCaP、PC3细胞的TK酶活性影响不明显.应用高效液相色谱法分析,以单加GCV组的GCV-TP浓度计作100％.在加入0.04μmolSDC后,GCV-TP浓度与不加SDC比较提高到(101.0±1.5)％,但差异无统计学意义(P＞0.05);加入5倍治疗剂量0.20 μmol SDC后,GCV-TP浓度提高到(106.0±4.5)％,差异有统计学意义(P＜0.05).并进一步通过细胞实验证实,SDC对Ad-hTERT-HSV-tk+ GCV杀伤前列腺癌细胞无明显增效作用,但是旁杀伤效应增加明显.结论 SDC对胸腺激酶依赖的GCV阻断前列腺癌进展有一定的增效作用,将天然药物SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk以及GCV联合应用,可以达到增效减毒的目的.     

HyTK基因转移联合丙氧鸟苷对人膀胱癌细胞株EJ体外杀伤作用

为探索ＨｙＴＫ基因转移对人膀胱癌的治疗作用，采用单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶＴＫ）基因转移联合丙氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）对通过逆转录病毒载体转导了ＨｙＴＫ基因的人膀胱癌细胞株ＥＪ细胞（ＥＪ／ＴＫ）进行体外杀伤。对分别培养及混合培养的ＥＪ细胞及ＥＪ／ＴＫ细胞，用不同浓度ＧＣＶ进行处理，然后观察细胞形态改变及测定活细胞数量。结果：在ＧＣＶ作用下，ＥＪ细胞形态及数量与对照组无明显变化；而ＥＪ／ＴＫ细胞受到ＧＣＶ明显杀伤，细胞形态破坏，细胞数量明显减少，含１０％ＥＪ／ＴＫ的混合培养细胞就可观察到很明显的杀伤作用。表明：转导ＨｙＴＫ基因的ＥＪ细胞获得了对ＧＣＶ的敏感性，并存在很强的“旁观者效应”。提示ＨｙＴＫ基因转移联合ＧＣＶ可能适用于人膀胱癌治疗。     

HSV-TK/GCV系统对前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应

目的 :研究胸苷激酶 (TK)自杀基因疗法对人前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应 ,探讨其治疗前列腺癌的可行性。方法 :采用形态学观察、活细胞拒染法及MTT法检测单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK) /羟基无环鸟苷 (GCV)系统对前列腺癌细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果 :GCV对转染TK基因前列腺癌细胞的杀伤作用呈剂量及时间依赖关系 (P <0 .0 5～ 0 .0 1) ;但其旁观者效应较弱 ,TK基因阳性细胞比例约为 10 %的混合细胞 ,经 10 μmol/L和 10 0 μmol/L的GCV处理 72h后 ,仅有16.15 %± 1.64 %和 2 3 .46%± 3 .2 1%的细胞被杀灭。结论 :HSV TK/GCV系统对前列腺癌有杀伤作用 ,但由于其旁观者效应不够强大 ,不能期望通过单纯的TK基因治疗达到前列腺癌良好的治疗效果     

TK自杀基因对甲胎蛋白阳性肝癌的特异性杀伤作用

目的观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统在体内外对人肝癌细胞的杀伤效应.方法在体外按MOI值为100、10、1、0用重组腺病毒转染人肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721,48 h后用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率.在两种肝癌裸鼠模型上,瘤体内注射重组腺病毒(1×1012 pfu/L)0.1 ml,GCV作用后观察抑瘤效果.结果体外MOI为100时,可杀死99.8%的BEL-7402细胞和17.8%的SMMC-7721细胞,两者差异有显著性(P＜0.05).体内BEL-7402组肿瘤生长明显受到抑制.结论在体内外,腺病毒介导的含AFP调控序列的HSV-tk/GCV自杀基因系统对甲胎蛋白(AFP)阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用,该系统可望用于肝癌的特异性基因治疗.     

人端粒酶逆转录酶启动子调节单纯疱疹病毒胸苷激酶和人白细胞介素12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的构建及意义

目的 构建由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调节的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和人白细胞介素12(hIL-12)融合基因表达载体.方法 利用聚合酶链反应(PCR)分别扩增hTERT启动子基因、HSV-TK基因和hlL-12 p70基因,并将其分别克隆至pShuttle载体上,合成pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12融合基因表达载体,并对所合成的载体酶切、测序检验.结果 各基因片段成功扩增,大小分别为1084、1173、1557 bp,并成功联结至pShuttle载体上.对所构建新载体分别行酶切鉴定,各融合基因片段大小与预计大小相符,DNA序列测定结果显示,与目标序列完全一致,无突变发生.结论 成功构建肿瘤特异性启动子调控的融合基因表达载体pShuale-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和更昔洛韦对膀胱癌细胞的旁观杀伤效应

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因和更昔洛韦（GCV）对膀胱癌细胞的旁观者效应和机制。方法：将转染HSV-tk基因的膀胱癌细胞HTB9与HTB9细胞混合培养，在GCV作用下，观测细胞的存活率。HTB9-tk细胞条件培养基，经不同孔径的滤膜过滤，将滤液及0.22μm滤膜上的物质重新加入HTB9细胞，观察细胞存活率。结果：当HTB9-tk细胞50％时，共培养细胞对GCV的敏感性近100％，表明每个表达HSV-tk基因的细胞至少杀死1个不含HSV-tk基因的膀胱癌细胞。HTB9-tk细胞的条件培养液过滤后直径大于0.22μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用。结论：HSV-tk/GCV对膀胱癌细胞具有明显旁观者效应的毒性作用，直径大于0.22μm的某种物质对HTB9细胞具有细胞毒性作用，其旁观杀伤效应机理可能是HTB9对HTB9-tk细胞凋亡囊泡的吞噬。     

逆转录病毒介导单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因对胰腺癌细胞的杀伤作用

目的：观察单纯疱疹病毒－胸苷激酶（HSV－tk)／丙氧鸟苷（GCV）基因治疗系统在体内外对人胰腺癌细胞的杀伤效应。方法：构建含HSV－tk基因的重组逆转录病毒载体pDOR-tk-neo,经病毒包装细胞PA317产生重组逆转录病毒,后者将HSV－tk基因转入人胰腺癌细胞系PC－2细胞内,筛选出稳定表达HSV－tk的细胞克隆PC－2／tk。测定PC－2/tk细胞在体外对GCV的敏感性及其旁观杀伤效应PC－2／tk细胞在裸鼠皮下成瘤,观察GCV的治疗作用。结果：GCV对PC－2/tk细胞有明显的杀伤作用,且其作用呈现剂量和时间依赖性特点以及旁观杀伤效应,对母本细胞则无明显毒性。裸鼠腹腔注射GCV后对移植瘤有明显治疗作用。结论：表达HSV－tk的人胰腺癌细胞在体内外均可被GCV有效杀伤。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗膀胱癌的实验研究

目的　观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV tk/GCV)自杀基因系统体外对人膀胱癌的选择性杀伤效应。　方法　利用不同感染复数(MOI)的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因感染膀胱癌细胞253J和人成纤维细胞MRC 5,荧光显微镜下观察其感染效率。利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad hTERT HSV/tk以及Ad CMV HSV/tk感染253J和MRC 5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受染细胞的存活率。　结果　重组腺病毒Ad hTERT EGFP能特异性转染253J细胞,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高(P<0. 01),MOI为1时转染率为8. 3%,MOI为1000时转染率达100. 0%;应用GCV处理后,Ad CMV HSV/tk对253J和MRC 5细胞均有杀伤作用,而Ad hTERT HSV/tk只杀伤253J细胞(P<0. 001),随着MOI和GCV浓度增加, 253J细胞存活率明显降低(P<0. 01),MOI为1、GCV浓度为1μmol/L时存活率为95. 4%,MOI为100、GCV浓度为1000μmol/L时存活率仅为6. 1%,并有旁观者效应。　结论　重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率,hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV tk/GCV自杀基因系统对人膀胱癌细胞有靶向杀伤作用。     

膀胱癌细胞RT4和253J中转移相关蛋白的差异表达及意义

目的 检测转移相关蛋白上皮型钙黏素(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)在膀胱癌细胞RT4和253J中的表达,从细胞黏附性和骨架蛋白角度探讨膀胱癌恶性进展的分子机制.方法 用Western blot法测定RT4和253J两种细胞中E-cadherin和Vimentin的表达差异,Millicell小室检测RT4和253J的体外侵袭能力,分析RT4和253J的细胞特性.结果 E-cadherin在RT4细胞中高表达、在253J细胞中低表达,而Vimentin在RT4细胞中表达缺失、在253J细胞中表达很高;Millicell证实253J细胞穿膜数较RT4细胞显著增多.结论 人膀胱癌细胞RT4和253J的E-cadherin、Vimentin表达及两种细胞的侵袭潜能差异无统计学意义,提示这两种蛋白的表达差异在促进或抑制膀胱癌的恶性进展中起重要作用.

Abstract：

Objective To detect the expression of metastasis-associated proteins in bladder cancer cells RT4 and 253J and explore the molecular mechanisms of malignant transition of bladder cancer. Methods The expression of E-cadherin and Vimentin in RT4 and 253J cells was detected by Western blotting.Millicell polycarbonate filter was used to analyze the invasive potency of RT4 and 253J cells. Results E-cadherin was detected with high expression in RT4 cells, whereas a very low expression in 253J cells:Vimentin was not detected in RT4 cells, but a high expression in 253J cells. Conclusion There was remarkable difference in the expressions of E-cadherin and Vimentin in RT4 and 253J cells, and there was different invasion characteristic in these two cell liness. E-cadherin and Vimentin play a key role in the malignant transition of bladder tumor.     

腺病毒介导HSV-TK／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌实验研究

目的观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷（HSV-TK／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方珐利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率;利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV／TK以及Ad-CMV-HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受转染细胞的存活率。结杲重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0.01）,MOI为1时转染率为8.3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad-CMV-HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad-hTERTp-HsV／TK只杀伤LNcaP（P〈0.001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0.01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol／L时存活率为95.4％,MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6.1％,并有旁观者效应。结论重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV-TK／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

microRNA-34a的表达对膀胱癌细胞系J82生物学行为的影响

目的:探讨microRNA-34a(miR-34a)的外源性表达对人膀胱癌J82细胞生物学行为的影响。方法:将miR-34a表达质粒或对照质粒转染J82细胞,实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-34a在转染细胞中的表达水平,细胞计数法、流式细胞术、Transwell侵袭实验分别检测外源性miR-34a表达后J82细胞增殖、凋亡、周期和侵袭能力的变化情况。结果:miR-34a表达质粒组与对照组比较,其miR-34a表达诱导性升高(P=0.002 6),细胞增殖受到抑制(P=0.000 1),细胞凋亡率增加(1.237%±0.116%vs 5.497%±0.293%;P<0.000 1),细胞周期阻滞于G0～G1期(54.510%±1.501%vs 62.200%±0.754%;P=0.001 5);细胞侵袭能力降低,(65.01±11.79)vs(34.33±9.71),P=0.025 4。结论:在膀胱癌J82细胞中增加miR-34a的表达,可抑制细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡和周期阻滞,并通过影响上述细胞生物学行为降低肿瘤细胞恶性度,miR-34a在膀胱癌细胞系中发挥潜在的抑癌基因作用。     

丝裂霉素对膀胱癌EJ细胞作用机制的研究

目的　从诱导坏死和凋亡角度探讨丝裂霉素 (MMC)对膀胱癌EJ细胞的作用机制。　方法　将不同浓度的MMC作用于膀胱癌EJ细胞 ,在不同时间内采用流式细胞术 (FCM )和 3’末端脱氧核苷酸转移介导生物素 (TUNEL)及伊红排斥实验检测EJ细胞的凋亡情况和对其的杀伤作用。　结果　不同浓度的MMC在 2 4h内可以持续诱导EJ细胞凋亡 ,MMC 0 .1mg/ml组 2 4h时凋亡率为 71% ,对EJ细胞的杀伤作用与剂量呈正比。　结论　MMC对膀胱癌EJ细胞的抑制作用是通过促凋亡机制和促坏死机制完成的     

蛋白激酶C-α在调节人膀胱癌T24细胞多药耐药中的作用

目的探讨蛋白激酶C-α(PKCα)对人膀胱癌T24细胞多药耐药的调节作用。方法将载有PKCα基因的表达质粒GFP-PKCα导入人膀胱癌细胞系T24。应用噻唑蓝(MTT)比色法,检测T24/PKCα及亲本细胞对阿霉素的敏感性,以及在激活(10nmol/LPMA2h)和抑制(10nmol/LCalphostinC2h)PKCα的情况下,T24/PKCα细胞对阿霉素敏感性的变化。同时用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因-1(MDR-1)、多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药相关蛋白(LRP)基因的表达。结果转染了PKCα基因后,T24细胞对阿霉素的耐药性增强(耐药指数7.52,P<0.05)。PKCα的激活显著提高了T24细胞的耐药性(耐药指数153.78,P<0.01),而抑制PKCα活性则使耐药指数降至1.20(P>0.05)。T24/PKCα的MDR-1表达水平是亲本细胞的2.28倍(P<0.01)。激活PKCα可使MDR-1基因表达水平较亲本细胞升高12.80倍(P<0.01),抑制PKCα则MDR-1表达下降(P>0.05),而MRP和LRP基因表达水平并无明显变化(P>0.05)。结论PKCα可能通过上调MDR-1表达,在人膀胱癌的化疗耐药中起到了重要的作用。     

Anticancer drug sensitivity in vitro in the bladder cancer cell line,KK-47 and prophylactic use of carbazilquinone and urokinase in bladder cancer

Summary Using colony formation technique and KK-47 cell line established from a human bladder transitional cell carcinoma, the effects of 6 anticancer drugs, thio-TEPA, Bleomycin, mitomycin C, carbazilquinone, Adriamycin and cis-Platinum, were compared. On the results of tests performed to establish the drug concentration required to achive a 50% inhibition of cell survival, carbazilquinone was chosen for the prevention of recurrences of bladder cancer. The two groups studied consisted of 56 patients (previously untreated group) who were rendered free of tumours by surgical intervention and of 19 patients (thio-TEPA failures group) who had experienced a persistent recurrence of tumours after prophylactic thio-TEPA instillations and were presumed free of the recurrence of tumours after the next surgical intervention. The 2 groups were subjected to prophylactic combined intravesical instillation therapy with carbazilquinone and urokinase. In the previously untreated group, 6 of the 56 patients (10. 7%) had a recurrence of tumours, and the recurrence rate after 21 months was 16. 7%, using the actuarial method. In the thio-TEPA failures group, 12 of the 19 patients (63. 2%) had a recurrence of tumours, a rate at 21 months of 76. 1%. A considerable drop in the recurrence rate was obtained by the combined instillation therapy in the previously untreated group. The results in the thio-TEPA failures group suggested the presence of a cross-resistance between both alkylating agents, and of a persistent susceptibility to multifocal lesions. No bone marrow depression was observed but an episode of anaphylactic shock attributable to the use of carbazilquinone occurred in 1 out of a total 75 patients.