体外培养人胎儿软骨细胞的生物学特性

目的建立人胎儿软骨细胞分离培养、扩增技术体系,研究其体外单层培养条件下的生长特性,探讨胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法酶消化法获取胎儿软骨细胞,体外培养扩增,经测定细胞生长曲线、群体倍增时间及累计倍增数目,观察细胞生长动力学并确定体外生长规律.通过免疫组织化学检测Ⅱ型胶原分泌,阿利辛蓝比色法测定基质糖胺多糖(GAG)含量.P1细胞接种于聚羟乙酸(PGA)纤维支架,观察两者生物相容性及细胞体外成软骨能力.结果关节软骨细胞形态呈典型的多角形,随着传代的次数增加,逐渐变成"成纤维细胞样"的条梭形.平均倍增时间为74 h.细胞连续培养5代,累计倍增数目为7.83±0.42.P1～P5间接免疫组化Ⅱ型胶原表达阳性,P6不表达.GAG含量P1细胞低于P0细胞,随体外培养时间延长逐渐增加.P1细胞接种于PGA纤维支架,体外培养14 d,组织学观察显示有软骨组织形成.结论胎儿软骨细胞经常规体外培养,至第6代失去分泌软骨特异性基质的功能.P1细胞接种PGA纤维展现良好的生物相容性,初步证实胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的：研究软骨组织工程中传软软骨细胞与原代的差异，方法：用5个月人胎关节软骨分离培养细胞，观察细胞存活率，贴壁率，生长曲线和组织形态学的改变。结果：（1）软骨块在4℃下，3天内细胞存活率可达93．4％－97．6％。（2）原代细胞为圆形或三角形；第4代有一半转变成梭形，到第6代全部变为长梭形。（3）传代细胞贴壁时间（2－3h)短于原代（4－7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78．7％－85．5％，原代8．8％。（4）生长曲线表明，从原代到第4代都有高增殖力；到第8代时增殖降低；到第12代几乎丧失细胞增殖。结论：软骨块4度冷藏，3天内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞壁壁快，增殖 ，适于作为组织工程用细胞，第8代以后不适合。     

不同培养时间软骨细胞的生物学特性

目的 探讨软骨细胞在体外不同培养时间的生物学特性。方法 把罗骨细胞置盖玻片上２,观察不同培养时间细胞的形态学变化和增殖能力,应用阿新蓝和三色染色,观察细胞在培养过程中酸性粘多糖（ＧＡＧ）、和胶原分泌情况。结果 软骨细胞经体外单层培养,传代４～５代后,细胞形态逐渐由多角形变为俊形,基质分泌减少,ＧＡＧ和胶原染色变浅。结论 软骨细胞在体外培养３周左右是作为有组织工程的最佳种子细胞。     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞。构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养，以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况；应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果 永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长，长期传代(50代)仍有很强的增殖能力，形态呈现多角形和三角形，GAG和胶原染色均呈阳性。结论 构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

猪耳廓软骨细胞体外培养

目的 为组织工程化软骨修复机体软骨缺损提供实验基础。方法 用消化组织块培养法体外培养猪耳廓软骨细胞。结果 软骨细胞在ＰＨ值为７．２０,含１０％胎牛血清的Ｆ１２培养基中生长良好,可传代４～５代,细胞数目扩增为原来的１０～２０倍。结论 消化组织块方法培养软骨细胞是一种可以扩增软骨细胞数目的确实可行的方法。     

体外培养大鼠耻骨联合软骨细胞的生物学特性

[目的]通过对大鼠耻骨联合软骨细胞的分离及体外培养,观察其生长、表型等一般生物学特点.[方法]采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶序贯消化法,从SD大鼠耻骨联合软骨组织中分离出软骨细胞,用含150mL/L胎牛血清的DMEM/F-12培养液原代和传代培养.分别以2g/L胶原酶消化2、6、12 h,分析不同消化时间获取的细胞数量及生长情况.对6 h消化组细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化染色,并观察第1、4、7代的生长曲线.[结果]经胶原酶消化2、6、12 h后,平均每100mg耻骨联合软骨获取的原代细胞数之间有统计学显著差异（P＜0.01）.消化6 h组可以获取数量丰富的原代细胞,生长状态好.大鼠耻骨联合细胞原代呈短梭形、三角形或多角形,有短细胞突起.Ⅱ型胶原免疫组化染色在第1、4代培养细胞均呈阳性,第7代培养细胞呈阴性.第7代细胞生长增殖比第1、4代慢.[结论]耻骨联合软骨细胞体外培养时属于有限细胞系.培养初期（第4代之前,含第4代）的细胞较好地保持了软骨细胞的表型,且增殖能力强,有可能作为软骨组织工程的种子细胞.     

体外传代培养对关节软骨细胞成软骨能力的影响

目的　研究不同代体外培养关节软骨细胞成软骨能力 ,选择软骨组织工程最佳种子细胞。方法　将兔膝关节软骨消化分离出软骨细胞 ,传代培养至第 6代 ,每代细胞与模板支架材料Pluron icF 12 7混匀形成复合物 ,使细胞浓度达 5× 10 7/ml,将复合物注射于自体兔背部皮下 ,9周后取材 ,进行大体观察、新生软骨湿重与体积测量、组织学观察。结果　体外培养关节软骨细胞随传代次数的增加 ,形态从圆形逐渐向梭形转变。 1～ 3代软骨细胞成软骨能力最强 ,新生软骨的湿重与体积最大 ,组织结构与正常软骨相同 ;第 4代成软骨能力减弱 ,软骨基质分泌减少 ,新生软骨湿重和体积减小 ,与前 3代比较差异有显著性 ;第 5代仅形成分散于纤维组织内的软骨细胞团 ;第 6代则未发现有软骨样组织形成。结论　①在体外单层培养条件下 ,随传代次数的增加关节软骨细胞逐渐去分化 ,成软骨能力逐渐降低直到完全丧失。②前 3代软骨细胞均具备形成正常软骨的能力 ,都可用作组织工程的种子细胞 ,但传代培养的目的是使细胞得以最大限度扩增 ,因此第 3代关节软骨细胞是可被应用的最佳种子细胞     

体外培养大鼠耻骨联合软骨细胞的生物学特性

 [目的]通过对大鼠耻骨联合软骨细胞的分离及体外培养,观察其生长、表型等一般生物学特点.[方法]采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶序贯消化法,从SD大鼠耻骨联合软骨组织中分离出软骨细胞,用含150mL/L胎牛血清的DMEM/F-12培养液原代和传代培养.分别以2g/L胶原酶消化2、6、12 h,分析不同消化时间获取的细胞数量及生长情况.对6 h消化组细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化染色,并观察第1、4、7代的生长曲线.[结果]经胶原酶消化2、6、12 h后,平均每100mg耻骨联合软骨获取的原代细胞数之间有统计学显著差异（P＜0.01）.消化6 h组可以获取数量丰富的原代细胞,生长状态好.大鼠耻骨联合细胞原代呈短梭形、三角形或多角形,有短细胞突起.Ⅱ型胶原免疫组化染色在第1、4代培养细胞均呈阳性,第7代培养细胞呈阴性.第7代细胞生长增殖比第1、4代慢.[结论]耻骨联合软骨细胞体外培养时属于有限细胞系.培养初期（第4代之前,含第4代）的细胞较好地保持了软骨细胞的表型,且增殖能力强,有可能作为软骨组织工程的种子细胞.     

兔角膜基质细胞的体外培养及生物学特性

目的 改进兔角膜基质细胞培养技术，观察其生物学特性。方法 先同时消化角膜上皮及内皮层，然后刮去上皮，内皮，前弹力和后弹力层，接着将剩余的基质层剪碎消化，接种，采用MTT法观察细胞生长情况，并对比有，无血清培养基对细胞生长的影响。结果 角膜基质细胞10d后形成细胞单层，增殖旺盛，有血清培养基培养到第8天左右达到生长高峰，无血清培养基培养的细胞生长较慢，第9天左右达到生长高峰，结论 改进的角膜细胞培养技术简便，成功率高，培养出的角膜基质细胞生长良好，血清对角膜基质细胞生长有一定的影响。     

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性。方法收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kap low氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达。结果诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成。结论分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征。     

胰岛素铁硒传递蛋白促进组织工程软骨形成的作用

目的研究胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)对组织工程软骨形成的影响。方法第2代猪关节软骨细胞单层培养或离心形成细胞聚集体,根据培养液不同分为2组:常规培养组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清)和ITS组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清+体积分数1%ITS),噻唑蓝(MTT)法评估2组软骨细胞增殖;细胞聚集体培养1、2、3、4周后取材,比较2组细胞聚集体大体形态、湿质量、组织学、Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组织化学染色和软骨特异基因表达。结果 MTT检测显示第5、6、7天ITS组光密度值显著高于常规培养组(P<0.01);ITS组软骨细胞聚集体体积在培养3周和4周时明显大于常规培养组;ITS组湿质量培养4周时为(7.91±1.49)mg,明显高于常规培养组的(5.37±1.31)mg(P<0.05)。ITS组细胞聚集体甲苯胺蓝染色和ColⅡ免疫组织化学染色明显强于常规培养组;2组软骨特异基因SRY相关高迁移组盒子基因9、ColⅡ表达相当,ITS组Ⅹ型胶原表达减弱,核心蛋白和Ⅰ型胶原表达增强。结论 ITS通过促进软骨细胞增殖和细胞外基质分泌可更好地促进组织工程软骨形成。     

软骨细胞与瑞福纳米人工骨复合物的体外构建

目的:评估瑞福纳米人工骨(胶原基纳米骨,nano-hydroxyapatie/collagen, nHAC) 作为软骨组织工程细胞支架材料的可行性.方法:选择骨性关节炎(OA)患者行髋关节置换手术后外观大致正常的关节软骨, 消化、分离、体外培养扩增后种植到nHAC中,复合物体外培养后进行Ⅱ型胶原免疫组织化学检测和扫描电镜观察.结果:软骨细胞可以长入nHAC支架材料中.同期软骨细胞保持了正常的外形且可分泌Ⅱ型胶原.结论:nHAC可以作为软骨细胞的载体.     

HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究

目的通过HBV体外感染22周龄原代培养人胎肝细胞,比较常用检测指标的敏感性和特异性.方法利用HBV阳性血清感染体外培养的原代人胎肝细胞.应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中cccDNA.结果胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2天出现阳性,培养上清和细胞中HBVDNA定量自第4天起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6天出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9天出现阳性.结论HBV在原代培养人22周龄的胎肝细胞中能够稳定复制和表达,各种检测指标的灵敏性和特异性不一,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg敏感性好,特异性可.     

骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究

目的 观察将骺板软骨细胞接种于自制的生物凝胶经体外培养生成软骨组织的生物学特点，初步评价这一凝胶基质作为软骨组织构建材料的生物学性能。方法 将第一代骺板软骨细胞接种于生物凝胶进行体外培养，行大体，倒置显微镜以及组织学，Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察。结果 骺板软骨细胞－生物凝胶复合的，在体外培养过程中不能春初始外形，培养1周直径可收缩为初始的45％，但能保持种子细胞的稳定均发布。经体外培养2周后由外周向中心逐渐形成软骨组织，表面为由1－3层梭形细胞组成的膜样结构，内部细胞主要为圆形细胞，有细胞外基质相隔，形成软骨细胞陷窝。基质中富含软骨特异性基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，而Ⅰ型胶原免疫组化逐渐转为弱阳性，位于表面膜结构。结论 这一生物凝胶具有良好的细胞相容性，适合软骨细胞在其中生成成熟的工程化软骨，但难以维持其初始外形。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的 探讨不同浓度软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建软骨的可行性。方法 将体外分别培养扩增的猪BMSC与耳软骨细胞按不同比例混合(9:1,8:2),均以5.0×107/mL的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种作为阳性及阴性对照,以20％上述浓度的单纯软骨细胞接种作为低软骨细胞浓度对照。各标本于体外培养4周时取材,通过大体观察、组织学以及免疫组化等方法对新生软骨进行初步评价。结果 各组细胞均与材料粘附良好。8:2共培养组及阳性对照组在体外培养4周时,外观已类似软骨组织并基本保持了材料的大小和形状,组织学显示有较连续的成熟软骨形成,免疫组化也均显示有大量Ⅱ型胶原分泌。9:1共培养组在培养过程中稍有缩小和变形,组织学上仅在培养物的边缘可见到连续的软骨样组织。阴性对照组明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝。低软骨细胞浓度组复合物明显变薄,只在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组。结论软骨细胞能够提供软骨微环境诱导BMSC成软骨分化并形成软骨,20％浓度的软骨细胞已能够达到良好的诱导效果。     

兔原代肋软骨细胞的三步酶消化法高效分离及体外培养观察

目的观察三步酶消化法分离兔原代肋软骨细胞的效果和收获效率,并观察其体外传代培养的生物学特性.方法三步酶消化法设计为以培养液配制的1g/L胰蛋白酶/1g/L EDTA、1g/L透明质酸酶和2g/LⅠ型胶原酶顺序消化肋软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化.结果①肋软骨经三步酶消化软骨基质逐步解离和降解,细胞被完全分离,每克软骨的细胞收获量平均为4 295.7×104个细胞,细胞存活率平均为97.2%.②原代和第1代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(80.61±11.40)μg/cm2;第3代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应亦明显减弱,第4代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(44.74±10.18)μg/cm2.结论①三步酶消化法能完全消化降解肋软骨基质,使细胞完全分离,并具有高细胞收获率和高细胞存活率.②原代和第1代肋软骨细胞具有良好的生物学活性.     

人骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的　探讨在骨组织工程研究中作为种子细胞来源之一的骨髓基质干细胞体外培养后的生物学特性 .方法　获取人胎儿骨髓于含 10 0 m L· L- 1 胎牛血清的 DMEM培养液中培养 ;将骨髓基质干细胞向成骨细胞方向进行诱导 ,2～ 3wk后行钙化结节 Vonkossa和碱性磷酸酶 (AL P)钙钴染色 ;同时绘制诱导前后细胞的生长曲线、测定细胞内 AL P含量变化 ,并做统计学分析 .结果　骨髓基质干细胞经诱导后增殖速度变慢 ,但合成 AL P的能力明显增强 (P<0 .0 5 ) ;Vonkos-sa和 AL P染色呈阳性 .结论　骨髓基质干细胞取材方便 ,易于诱导为成骨细胞 ,作为骨组织工程的种子细胞应用前景良好 .     

永生化软骨细胞体内软骨形成的实验研究

目的　探讨以永生化软骨细胞作为种子细胞构建和形成软骨的可能性。方法　把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)导入兔髁状突软骨细胞 ,G418筛选 ,挑选阳性克隆扩增培养 ;实验组将扩增培养的转染细胞与细胞支架材料 β 磷酸三钙 ( β TCP)复合 ,对照组将正常软骨细胞与 β TCP复合或单纯 β TCP在体外培育后种植于裸鼠皮下 ,3和 6个月取材进行组织学和免疫化学检测 ,并与对照 1组和对照 2组进行比较。结果　实验组和对照 1组可见复合体包裹软骨样组织 ,对照 2组有少量纤维样组织形成。免疫组化染色显示 ,实验组番红“O”、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色呈强阳性 ,有明显软骨组织形成 ,与对照组有显著性差异 (P <0 0 1) ,对照 1组染色呈弱阳性 ,对照 2组则为阴性。结论　永生化软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞 ,具有较好的软骨形成能力     

Cryopreservation and culture of the human fetal brain tissues

Summary Human embryos after 3–4.5 months of gestation were obtained with abortion. The brain tissue of the bodies was scissored up to obtain 1–3 mm³ pieces, and 7% dymethyl sulfoxide (DMSO), as a cryoprotectant, was added, and then stored at −70°C for 1–30 days or at −196°C for 1–84 days. The survival rate of stored cells was 64%–88%. During 6 days of storage with neuron culture medium, the survival rate of cells at 4°C is over 50% each day, but, as time goes on, the count of the cells is getting less and less. The cells washed out DMSO after cryopreservation and the planting fresh cells can adhere to the wall of the culture bottle, grow, display various forms of neurons and gliacytes. From the above findings, it was suggested that: 1) The fetal human brain tissue, handled properly, can endure cryopreservation with7% DMSO as a cryoprotective agent; 2) The storage time was related insignificantly to the survival rate of the tissues stored; 3)It is available for a short proservation at 4°C and 4) It is possible to set up a bank of fetal human brain tissue.