人IκBα真核表达载体的构建及其在大鼠肝移植缺血-再灌注损伤中的作用

目的:构建人IκBα真核表达质粒,探讨对大鼠肝移植缺血-再灌注损伤的保护作用。方法:应用RT-PCR和重叠延伸PCR技术,得到点突变的人IκBα,定向克隆至PcDNA3.0真核表达载体。将SD大鼠原位肝移植模型分为三组:Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为PcDNA3.0空载体转染组,Ⅲ组为PcDNA3.0-IκBα转染组。分别于术后2、12、24和72 h取材。用RT-PCR测定肝组织中核转录因子(NF-κB)p65、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)mRNA的表达及肝功能变化。结果:经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确;Ⅲ组与Ⅰ组、Ⅱ组相比:NF-κBp65、TNFα、ICAM-1 mRNA的表达水平及肝酶学指标均明显降低(P<0.05)。结论:真核表达质粒PcDNA3.0-IκBα构建成功,IκBα通过抑制NF-κBp65 mRNA的表达及其核移位减轻大鼠肝移植缺血-再灌注损伤。     

人IKBα真核表达载体的构建及其在大鼠肝移植缺血-再灌注损伤中的作用

目的：构建人IxBα真核表达质粒，探讨对大鼠肝移植缺血-再灌注损伤的保护作用。方法：应用RTPCR和重叠延伸PCR技术，得到点突变的人IkBα，定向克隆至PcDNA3．0真核表达载体。将SD大鼠原位肝移植模型分为三组：Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组为PcDNA3．0空载体转染组。Ⅲ组为PcDNA3．0-IkBα转染组。分别于术后2、12、24和72h取材。用RT—PCR测定肝组织中核转录因子（NF—KB）065、肿瘤坏死因子α（TNF—α）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）mRNA的表达及肝功能变化。结果：经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒构建正确；Ⅲ组与Ⅰ组、Ⅱ组相比：NF—kBp65、TNFα、ICAM-1mRNA的表达水平及肝酶学指标均明显降低（P〈0．05）。结论：真核表达质粒PcDNA3．0-IkBα构建成功，IkBα通过抑制NF—kBp065mRNA的表达及其核移位减轻大鼠肝移植缺血-再灌注损伤。     

IκBα突变体的真核表达载体构建及表达

目的:构建NF-κB的抑制蛋白IκBα突变体(IκBαM)的真核表达载体,检测其在内皮细胞中的表达。方法:从克隆质粒pSP64TL-IκBαM中用限制性内切酶双酶切IκBαM cDNA片段,克隆到真核表达质粒pcDNA 3.1/myc-His A内构建pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒,并酶切鉴定及测序分析。以脂质体法转染内皮细胞,观察其表达及活性。结果:pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒含有大小正确的IκBαM cDNA碱基片段,其碱基序列为编码目的基因的正确序列。pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM质粒能在内皮细胞中表达,并抑制IL-6分泌。结论:真核表达质粒pcDNA 3.1/myc-His A-IκBαM构建成功,IκBαM蛋白在内皮细胞中表达,并具有良好的生物学活性。     

突变型IκBα cDNA的克隆及其表达载体的构建

大量研究显示，慢性粒细胞白血病、急性髓系白血病以及淋巴细胞性白血病等均具有持续活化的核因子κB（nuclearfactor—κB，NF—κB）。因此，NF—κB的活化可能与白血病发生及其进展密切相关。NF—κB活化后，除了可调节参与细胞生长和增殖相关基因的表达外，还可上调凋亡抗性分子如cIAP1和TRAF1等基因的表达，从而使肿瘤细胞逃避凋亡。相反，抑制NF．κB活性，则能诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。因此，研究白血病细胞NF—κB的活化及其调控对揭示白血病的发病机制以及寻找白血病治疗新的靶分子具有重要意义。     

缺血后处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤及NF-κB表达的影响

[目的]探讨缺血后处理对大鼠肾缺血再灌注损伤影响。[方法]夹闭左侧肾动脉60 min后再灌注6 h法制备肾脏缺血再灌注损伤模型。雄性SD大鼠18只随机分为3组：缺血再灌注组（IR组,n=6）,缺血后处理组（IPO组,n=6）,假手术组（Sham组,n=6）。测定血肌酐（Cr）浓度、尿素氮（Bun）,检测肾脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和髓过氧化物酶（MPO）活性;取左肾组织行HE染色,光镜下观察肾组织病理学改变,免疫组化法检测肾组织中NF-κB表达。[结果]与Sham组比较,IR组血Cr浓度和血Bun浓度上升,达到（93.02±13.44）μmol/L和（15.58±0.56）mmol/L（P〈0.01）,SOD活性下降为（185.87±17.68）U/mgprot（P〈0.01）,MDA含量和MPO活性增加分别达到（4.09±0.34）nmol/mgprot、（0.90±0.07）U/g（P〈0.01）。与Sham组比较IPO组血Cr、Bun浓度、MPO活性差异有统计学意义（P〈0.05）,SOD活性和MDA含量差异无统计学意义;病理损伤明显,肾脏组织中NF-κB表达增强。与IR组比较,IPO组血Cr和血Bun浓度降低分别为（58.98±8.02）μmol/L（P〈0.01）、（9.45±1.03）mmol/L（P〈0.01）,SOD活性升高为（230.90±9.19）U/mgprot（P〈0.01）,MDA含量降低为（3.67±0.20）nmol/mgprot（P〈0.01）,MPO活力降低为（0.78±0.06）U/g（P〈0.01）,病理损伤减轻,肾脏组织NF-κB表达减弱。[结论]缺血后处理对肾脏有保护作用,其机制与增强肾脏抗氧化能力,减轻肾脏组织炎性细胞浸润和抑制肾组织NF-κB表达有关。     

人突变型IκBα真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建人突变型IκBα真核表达质粒。方法：应用RT—PCR及重叠延伸PCR技术，得到点突变的人IκBαM，并定向克隆至PcDNA3．0真核表达载体，酶切和DNA序列测定鉴定。结果：经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒PcDNA3．0-IκBαM构建正确。结论：真核表达质粒PcDNA3．0-IκBαM构建成功，为进一步研究其生物功能打下基础。     

大鼠缺血再灌注心肌TLR4，TNF-α，NF-κB表达及其关系

目的：研究缺血再灌注大鼠心肌TLR-4,TNF-α仪和NF-κB的表达及相互关系．方法：建立大鼠缺血再灌注模型,大鼠随机分为假手术组、缺血组、再灌注30min组、再灌注60min组、再灌注90min组．以RT—PCR法检测心肌中TLR4及TNF—α mRNA的表达．结果：各种心肌中均检测到TLR4的表达,缺血及再灌注后TLR-4 mRNA含量显著增加,随着再灌注时间延长,TLR-4 mRNA含量增加更为显著．缺血组与假手术组TNF—α mRNA表达无统计学差异,而再灌注后表达显著增加,随再灌注时间延长,TNF-α mRNA含量继续增加更为明显．缺血及再灌注后心肌NF—κB mRNA表达增加,随再灌注时间延长,NF—κB mRNA含量继续增加,具有统计学意义．TLR-4表达增加时TNF—α和NF-κB表达也增加,三者有一定相关性．结论：心肌缺血再灌注损伤使TLR-4,TNF—α表达增高,阻断TLR-4可能有助于减轻缺血再灌注所致心肌损伤,并抑制急性炎症反应的发生．     

脂多糖预处理对大鼠肝移植缺血再灌注期肝脏NF-κB活性和ICAM-1/LFA-1分子表达的影响

目的:探讨脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)预处理对大鼠肝移植缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤中肝脏核因子-κB(Nu clear factor-κB,NF-κB)活性和细胞间粘附分子-1/淋巴细胞功能相关抗原(Intercellular adhension mokule-1/Lymphocytefunction associated antingen-1,ICAM-1/LFA-1)分子表达的影响及意义.方法:雄性SD大鼠,分为假手术组(sham组)、原位肝移植组(OLT组)和原位肝移植+LPS预处理组(LPS组).Sham组只开腹分离肝十二指肠切带,OLT组和LPS组按两袖套法进行肝移植.Sham组于分离肝十二指肠韧带后O、60、180min、OLT组和LPS组于门静脉血流恢复后0、60、180 min分别测定各时相点肝组织NF-κB活性、ICAM-1/LFA-1分子表达及血清ALT、AST水平.结果:再灌注后0、60、180 min,OLT组与LPS组的NF-KB活性、ICAM-1/LFA-1分子表达均高于sham组(P<0.01);再灌注后0 min,OLT组与LPS组的NF-κB活性、ICAM-1/LFA-1分子表达和ALT、AST水平差异无统计学意义(P>0.05);再灌注60、180 min,OLT组的NF-κB活性,ICAM-1/LFA-1分子表达,ALT、AST水平均明显高于LPS组(P<0.01).结论:大鼠肝移植再灌注期内毒素信号转导通路的NF-κB活性增强,上调ICAM-1/LFA-1分子表达对移植肝造成损害;脂多糖预处理可有效抑制大鼠肝移植I/R中肝脏NF-KB活性、F调ICAM-1/LFA-1分子表达,对大鼠移植肝的缺血再灌注损伤有明显保护作用.     

葛根素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后NF-κB表达的影响

目的 探讨葛根素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后NF-κB表达的影响.方法 雄性SD大鼠,建立肝脏缺血再灌注模型(HIR),随机分为假手术组、HIR组和HIR-葛根素预处理组.肝脏缺血再灌注后,通过Western blot方法,分析大鼠肝脏组织中NF-κB蛋白表达的变化.同时利用RT-PCR法,观察大鼠肝脏组织中NF-κB mRNA表达水平的变化.结果 与假手术组相比,大鼠肝脏缺血再灌注损伤后,肝脏组织中NF-κB的蛋白表达和mRNA表达水平均显著升高,而经过葛根素预处理后,模型组动物肝脏组织中NF-κB的蛋白表达和mRNA表达水平均显著降低. 结论 葛根素可以调节NF-κB的表达,可能是葛根素保护大鼠肝脏缺血再灌注损伤的机制之一.     

褪黑素对缺血再灌注后大鼠肝脏NF-κB表达及iNOS的影响

目的探讨褪黑素对缺血再灌注后大鼠肝脏NF—κB表达及iNOS的影响。方法采用大鼠部分肝缺血再灌注模型，将健康雄性SD大鼠78只随机分为假手术组（S）、缺血再灌注组（I／R）、褪黑素处理组（Mel）3组．分别检测标本中NF—κB表达和iNOS含量。结果S组无NF-κB阳性表达；I／R组和Mel组经历单纯的肝脏缺血后，NF—κB的表达与S组无差异（P〉0．05），而再灌注后两组均有不同程度的NF—κB表达增加，并均于6h时点处达到各自峰值，Mel组于再灌注后各相应时点NF—κB的阳性表达率显著低于I／R组（P〈0．01）。再灌注后0～1h，3组iNOS活力无差异（P〉0．05），此后，I／R组iNOS活力随再灌注时间的延长而较S组显著上升（P〈0．01），其高峰亦在9h时点处出现，Mel组再灌注1h后各时点iNOS活力均较I／R组显著下降（P〈0．01）。结论褪黑素可以有效下调肝脏I／R过程中NF—κB的表达，抑制iNOS的活力，发挥其对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。     

姜黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤时NF-κB、ICAM-1的影响

目的 观察大鼠脑缺血再灌注损伤时海马神经元NF-κB及ICAM-1随再灌注时间表达变化,探讨姜黄素脑保护的分子机制.方法 制作SD大鼠全脑缺血再灌注损伤模型.实验分为S组、IR组、Cur组及SC组.HE染色观察海马锥体细胞形态改变、免疫组化观察海马NF-κB蛋白的表达,酶联免疫吸附试验测定海马组织ICAM-1蛋白含量.结果 IR组细胞轮廓消失,大部分细胞出现核固缩、碎裂.Cur组70%细胞边界基本清楚,核形状基本规则.Cur组海马CA1区在再灌注后各时间NF-κB的表达水平均低于相应时间点IR组(P<0.05).Cur组海马ICAM-1蛋白含量均低于IR组及SC组,其中在1 d和3 d有显著差异(P<0.05).结论 姜黄素可能通过抑制ICAM-1、NF-κB的表达减轻缺血再灌注神经元损伤.     

rhGH对大鼠肝脏缺血再灌注损伤中NF-κB P65蛋白表达的影响

目的探讨重组人生长激素(rhGH)对肝脏缺血再灌注损伤中的NF-κB P65蛋白表达的影响.方法Pringle’s法建立100只肝脏缺血再灌注损伤模型,实验组于建立模型前7 d每天给予重组人生长激素(rhGH)针剂皮下注射(0.2 IU/100 g体重),对照组等量的生理盐水注射,应用蛋白质印迹实验(Westernblotting)和免疫组化法检测NF-κB P65蛋白表达水平.结果rhGH组肝细胞NF-κB P65蛋白表达水平及活性均明显低于对照组(P<0.05).结论rhGH能下调大鼠肝脏缺血再灌注损伤中NF-κB P65蛋白的表达,从而减轻肝脏缺血再灌注损伤.     

供肝冷保存再灌注期间核因子NF-κB和抑制蛋白IκBs的变化及其意义

目的:研究肝移植期间供肝组织中核因子NF-κB的激活特征及其活性调控机制.方法:改良Kamada法建立大鼠原位肝脏移植模型,按供肝在4℃乳酸林格液中的冷保存时间,实验分冷保存2 h组和6 h组,凝胶迁移率改变分析法(EMSA)和Western印迹法测定移植期间不同时相供肝组织中NF-κB的活性变化及其主要抑制蛋白IκB-α、IκB-β的表达水平.结果:两组供肝组织在冷缺血保存期间其NF-κB活性与正常肝组织相比无明显差异(P>0.05),再灌注后30 min至6 h两组的NF-κB活性均出现显著的诱导激活(P<0.01),其中冷保存2 h组供肝组织的NF-κB活性高峰出现在再灌注1 h;而冷保存6 h组在再灌注30 min即达到活性高峰,并维持在较高的激活水平;供肝组织中抑制蛋白IκB-α的含量显著高于IκB-β,两组的IκB-α蛋白在再灌注30 min至1 h均有明显降解(P<0.05),而IκB-β蛋白仅在冷保存6 h组有较明显的降解(再灌注30 min).结论:核因子NF-κB仅在供肝的再灌注早期呈诱导性激活,其激活特征与供肝的冷保存再灌注损伤有关,抑制蛋白IκB-α在供肝的NF-κB活性调控中可能起了主要作用.     

葛根素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后NF—κB表达的影响

目的探讨葛根素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后NF—κB表达的影响。方法雄性SD大鼠,建立肝脏缺血再灌注模型（HIR）,随机分为假手术组、HIR组和HIR-葛根素预处理组。肝脏缺血再灌注后,通过Western blot方法,分析大鼠肝脏组织中NF—κB蛋白表达的变化。同时利用RT—PCR法,观察大鼠肝脏组织中NF—κBmRNA表达水平的变化。结果与假手术组相比,大鼠肝脏缺血再灌注损伤后,肝脏组织中NF—κB的蛋白表达和mRNA表达水平均显著升高,而经过葛根素预处理后,模型组动物肝脏组织中NF—κB的蛋白表达和mRNA表达水平均显著降低。结论葛根素可以调节NF—κB的表达,可能是葛根素保护大鼠肝脏缺血再灌注损伤的机制之一。     

核因子κB在大鼠胃缺血再灌注损伤中的表达及意义

目的研究核因子κB(NF-κB)在大鼠胃缺血再灌注损伤中的表达及意义。方法采用大鼠胃缺血再灌注(gastric ischemia/reperfusion,GI/R)模型(夹闭腹腔动脉30 min后再灌注),分别于再灌注0.5、1、32、4 h取胃,计算胃黏膜损伤指数。应用免疫组化、Western blot方法检测胃黏膜NF-κB p65。结果大鼠GI/R后引起胃黏膜损伤,再灌注1 h时损伤最明显,随后降低,24 h接近正常。GI/R后胃黏膜NF-κB阳性细胞数和蛋白表达量增多,与胃黏膜损伤变化规律一致。结论NF-κB在大鼠GI/R损伤过程中发挥着重要作用。     

厄贝沙坦对大鼠脑缺血再灌注后NF－κB和IκBα的影响

目的:观察厄贝沙坦对大鼠脑缺血再灌注后缺血区炎症因子的影响?方法:将健康的雄性SD大鼠随机分为3组,即假手术组?缺血再灌注(I/R)组?厄贝沙坦预处理组?厄贝沙坦预处理组在制备模型前给予厄贝沙坦30 mg/(kg·d)干预3周,采用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型?脑缺血90 min再灌注24?72 h后用Longa标准进行神经功能评分,用Western blot法测大鼠脑缺血组织内NF-κB p65?IκBα的表达水平?结果:①与I/R组相比较,厄贝沙坦组神经功能缺损程度评分明显改善(P < 0.05);②脑缺血再灌注后24及72 h,I/R组缺血区NF-κB p65的表达明显高于假手术组(P < 0.01),与I/R组相比较,厄贝沙坦预干预组缺血区NF-κB p65的表达明显降低(P < 0.05);③脑缺血再灌注后24 h,I/R组缺血区IκBα的表达高于假手术组(P < 0.05),与I/R组相比较,厄贝沙坦预干预组缺血区IκBα的表达明显增高(P < 0.05)?结论:厄贝沙坦可通过提高IκBα的表达,抑制NF-κB的表达,改善大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经功能缺损,对脑缺血再灌注起保护作用?     

人IκBα基因的克隆和原核表达

目的:构建人类IκBα基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,为研究IκBα基因的功能奠定基础。方法:从cDNA文库获取目的基因,经PCR扩增目的片段IκBα;利用分子克隆技术构建原核表达质粒;转化入大肠杆菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,进行纯化,获得目的蛋白。结果:成功构建pET-28a-IκBα重组表达质粒;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示:IκBα在pET-28a-IκBα表达载体中获得表达量较高的融合蛋白,主要以上清形式存在。结论:成功表达并纯化获得了高纯度的IκBα蛋白。     

细胞粘附分子1在大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤中的表达

近年研究证明,某些粘附分子是内皮细胞和白细胞粘附的原因,其中,l型细胞粘附分子（ICA－1）及其配体白细胞功能相关抗原一l（LFAI）尤其重要,据报道,抗ICAM－l单抗可抑制体内沙帕细胞的粘附。'"。为此,我们应用大鼠同基因原位肝移植冷缺血再灌注损伤动物模型,探讨ICAM－l在大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤中的发病机制及其表达意义。一、材料和方法1．材料：雄性健康Wistar大鼠,供体重180－230已受体重ho－300g,购于中国科学院上海动物中心。小鼠抗大鼠ICAM司单抗IA29IgG及IA29F（ah'）,购于日本东京SeihagakllKOgyo…     

核因子κB在原代神经细胞缺血再灌注的表达

目的 :观察核因子κB(nuclear factor κB ,NF κB)在胎鼠原代神经细胞中的表达及转移情况并讨论其意义 .方法 :体外培养的原代神经细胞经类缺血处理后再复氧 ,用免疫荧光抗体染色、流式细胞仪检测NF κB的表达 .结果 :免疫荧光抗体染色显示 ,缺血再灌注后NF κB表达增高并由胞质转入胞核 ,流式细胞仪检测示缺血再灌注前后NF κB的表达分别为 1.3 %和 3 8.7% ,有显著性差异 (P <0 .0 1) .结论 :NF κB存在于神经细胞内 ,缺血再灌注后NF κB被激活并由胞质转入胞核 ,发挥其基因调控作用     

辛伐他汀对肢体缺血再灌注肺损伤大鼠肺组织中NF-κB及ICAM-1表达的影响

摘要：目的探讨辛伐他汀对肢体缺血再灌注(I/R)肺损伤大鼠肺组织核因子-κB（NF-κB）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表
达的影响及其机制。方法成年雄性SD大鼠48只,体质量250~300 g,随机分为6组（n=8）：假手术组（C组）、肢体缺血再
灌注组（IR组）分别给予等容量的(1 ml)的蒸馏水、辛伐他汀1、5、10 mg/(kg·d)组（S1组、S5组、S10组）和辛伐他汀对照组（S
组）分别于每日清晨将1、5、10、10 mg/(kg·d)辛伐他汀溶于1 ml蒸馏水灌胃1次,连续3 d,IR组、S1组、S5组和S10组于最后1
次给药后2 h行肢体缺血再灌注。再灌注3 h末行血气分析,观察肺组织病理学变化,测定肺组织湿/干质量比（W/D）、多
形核中性粒细胞（PMN）数目、MPO活性、NF-κB p65mRNA及ICAM-1蛋白的表达。结果与C组比较,IR组肺组织病理
损伤较重,PaO2降低,W/D、PMN计数和MPO活性升高（P<0.01）;与IR组相比,S1组、S5组和S10组减轻了肺组织病理损伤,
PaO2升高,W/D、PMN计数和MPO活性降低,NF-κB p65mRNA及ICAM-1蛋白表达下调（P<0.01）。结论辛伐他汀可减
轻肢体I/R大鼠的肺损伤,其机制可能与抑制NF-κB激活,从而减少ICAM-1介导的中性粒细胞浸润有关。